单核-巨噬细胞趋化功能的检测
互联网
8982
单核-巨噬细胞趋化功能的检测
【试剂及材料】
（1） 趋化因子（见附注）
（2） Hanks液（pH7.2）
（3） 特制的上、下两层多孔趋化小室
（4） Giemsa或瑞氏染液
【操作方法 】
（1） 分离单核细胞，用Hanks液（pH7.2）调整为2～3×105 细胞/ml；
（2） 将趋化因子液25μl加入趋化小室的下室。将滤膜光泽的一面朝向趋化因子盖在孔上，并将滤膜左上方剪去一小角；
（3） 盖上趋化小室的上室部分，用固定器夹紧；
（4） 将单核细胞悬液50μl注入上室。操作时不能产生气泡，因气泡妨碍细胞的移动；
（5） 各孔注入单核细胞悬液后，盖以25mm×80mm的载玻片，覆盖全部孔。在37℃，5％CO2 温箱中静置90min诱导细胞趋化移动；
（6） 从温箱中取出多孔趋化小室；松开固定器，将小室上、下倒置放在预先准备好的纸垫上，取下滤膜；
（7） 将事先切下一角的滤膜一边用大铗子固定，另一侧用小铗子夹好；
（8） 将朝向单核细胞的滤膜面（即无光泽面朝下）浸入生理盐水盘内，将大铗子一边的滤膜从液体中轻轻拉起（与容器呈30o 角），即可将未移动的细胞从滤膜上洗脱下来；
（9） 将滤膜光泽面朝上，贴在事先涂有蛋清甘油（甘油与蛋清等量混合而成）的载玻片（40mm×80mm）上，冷风吹干滤膜后，用甲醇固定，进行Giemsa或瑞氏染色；
【结果分析】
用低倍镜确认移动细胞后，换用400倍高倍镜任意计数10个视野内的移动细胞的总数，其结果为××个细胞/10 HPF（高倍视野），每个样品至少重复计数3次。如用缓冲液代替趋化因子，细胞数超过100/10 HPF时，应重新调整单核细胞数再检测。
【注意事项】
（1） 试验中一般用人或动物外周血分离的单核细胞，如以动物腹腔中MΦ作为指示细胞时，需在缓冲液中加入牛血清白蛋白或小牛血清，否则效果不佳。
（2） 如用聚碳酸酯（polycarbonate）滤膜时，应注意其正反面，必须将有光泽的一面作为吸引物面。Nucepore公司出品的趋化试验用滤膜分为PVP处理和未经过处理的两种。前者适用于单核-巨噬细胞，后者适用于中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。也有人将未经PVP处理的滤膜用明胶或L-赖氨酸覆盖后，用于纤维母细胞或内皮细胞移动功能的检测。
（3） 多孔趋化小室装置不能浸入有机溶剂或洗涤剂中，否则会造成丙烯树脂溶解或洗涤剂在孔内的沉着；也不能放入烘箱烤干，只能用大量流水冲洗干净，再用双蒸水冲洗后自然干燥。
（4） 单核细胞数和培养时间随滤膜孔径而改变，应事先选择最适条件。
【附注】趋化因子的制备
（1）常用酵母多糖活化的血清作为趋化因子。取酵母多糖加到新鲜血清中，浓度为 2mg/ml，37℃水浴保温30min后，3000r/min离心30min。
（2）上清液再经56℃30min加热处理，即为趋化因子，-30℃保存。加样前在37℃预温10～20min。
