材料与仪器
步骤
基 本 方 案 1 抗原特异性的抗体产生
材 料
200ul 完全培养基重悬细胞（两种板）。在测定前将细胞置于冰上。
基 本 方 案 2 Jerne-Nordin PFC 测定法
材 料
2 X R P M I 1640 培养基中含碳酸氢盐（Invitrogen)
SeaPlaque 低 熔 点 琼 脂 糖（F M C BioProducts)
5.—次 分 配 50 ul T N P -S R B C 到 6〜8 管中。检 测 1 或 2 张玻片，将混合物倒在玻片上并沿管子边缘扩散开（玻片是橙红色）。
6 .从洗涤过的培养板中的第一孔转移 IOOul 细 胞 出 来（如果用多克隆刺激剂可用小点的体积，如 20〜50ul; 如果诱导剂很弱可以用大点的体积，如 120ul)，吹打孔底多次使得所有的细胞都转移到含琼脂糖的第一管中。
7 .将水浴中的玻璃管拿出，紧握住玻璃管防止溅出内容物，用 有 2 片纱布的橡皮垫的混和器混旋。颠倒玻璃管将混合物倒入第一张玻片。迅速通过玻璃管管口扩散琼脂糖于玻璃表面上。
8 . 重复步骤 6 和 7 处 理 完 1 0 个管子；在玻片干之前不能移动，也不能使它们表面向上太长时间否则会干掉。在第一批 5〜1 0 个玻片做好之后，将它们上面朝下放在自制的玻片盒上。
9 . 剩余的玻璃管和玻片重复步骤 5〜8 直到所有的培养物都从管内转移到玻片上。
10.将 玻 片 盒（或玻片架和染色缸）重叠起来，将另外一个玻片盒放在上面，用湿布和大 塑 料 袋 盖 上（后者可选）。
11.在 无 C O 2 的 37°C 环境下培养 lh。
12.用 D P B S 稀 释 豚 鼠 补 体（通常每个玻片盒需要 48 ml 1 : 2 0 或 1 : 2 5 稀释的补体），温 和 混 匀（不要剧烈振荡），维 持 在 37°C 的环境下。
13.从玻片盒外去除湿布。用 IOml 或 20m l 移液管将稀释的补体从玻片的一端淹没玻片 ，移液管头要接近玻片的边缘，确保在玻片下没有气泡。
14.在无 C O 2 的 37°C 环境下培养 lh。
15.将玻片轻轻放在玻片架上，然后将玻片架浸泡在含有 0.85% (m /V ) 的氯化钠的染色缸中。
16.立即观察玻片或在 4°C 保存几个小时后观察。并 在 低 倍 双 目 解 剖 显 微 镜（放 大 10倍）下用间接光照亮琼脂糖层计数空斑数目。空斑在琼脂糖的 S R B C 层里显现成色圈样。如果在空斑处看到了颗粒，那么认为这是个假空斑
基本方案 3 Cunningham-Szenberg PFC 测定法
适当的吸收豚鼠补体对这项检测很重要。并 且 ，补体溶化后应该立即使用，不要再次冻存。所有的试剂应于室温时使用以避免在小室中形成气泡。玻片小室应该在灌满之后 的 20m i n 内用蜡封起来以避免干燥。
材 料
蜡（组织制备级）
含添加物的 R P M I 或 IF1 2 完全培养基
7.5% (V7 V ) S R B C 或 1 5 % T N P - S R B C (见辅助方案 3)
从培养细胞中洗涤的 B 细 胞（见基本方案 1)
完全培养基里的 5 0 % (V /V ) 豚 鼠 补 体（如 Life Technologies， ColoradoSerum)
120 cm2 玻璃培养皿
9 6 孔 U 形底微量滴定板
的 角 上（图 2.5. 2A )。
转 移 的 细 胞 数 目 应 该 调 整 为 不 多 于 75〜 IOOPFC/ 小 室 。
4.将它们浸没在热蜡中使小室的两边封闭（步 骤 1)。将玻片放置于玻片架上或 C O 2 培养箱的托盘上。并 在 37°C 条件下培养 lh。
5.用肉眼或者用 1 0 倍解剖显微镜计数空斑（通过模糊的边缘和没有反射性的特性与气泡相区别；图 2.5. 2B )，轻轻移动玻片防止摇晃，避免扰乱单层。
![备 选 方 案 1 改 良Jerne»Nordin PFC测定法用于型特异性反应 Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基本方案 2 ) 可 以 改 良以测定除I g M 以 外 的 其 他 Ig 类型。为达到这个目的，先按照Jem e-N ordin P F C 测定法步骤 1〜4 进行。然后，在加 有 T N P -S R B C 的玻璃管里加入50M 1稀释的羊抗IgM (如 1 : 1 0 0 ; 凭经验决定） （步骤 5 ) 以抑制I g M 的检测。同时，加 入 50/xl稀 释 的 （如 1 : 2 0 0 ; 凭经验决定）兔对需要 测 定 的 Ig同 型 （如 I g G K IgG2、 IgG3 或 IgA) 的抗血清。检 测 1 或 2 张玻片然后加工 玻 片 （步 骤 6〜10) 。 于 37°C培 养 90〜120m in。 加入豚鼠补体完成测定（步 骤 12〜16)。 备 选 方 案 2 改 良JernundefinedNordin PFC测定法用于测定多克隆抗体反应 除了测定特异同种型的反应（见备选方案1 ) 夕卜， Jeme-Nordin P F C 测 定 法 （见基 本 方 案 2 ) 也可以被改良测定多克隆抗体反应。这种方法利用葡萄球菌A 蛋白结合兔抗 体的能力以及相对容易得到的兔源性抗小鼠I g 同种型。分泌的抗体可以接合于连接在 蛋 白 质 A 的兔抗同种型抗体上，整个复合物能固定补体从而溶解R B C 。 为完成这个方法，用氯化铬包被蛋白质A 于 S R B C 上 （见 辅 助 方 案 4)。如前所述 准 备 玻 璃 管 （见基本方案2 , 步 骤 1〜4)，但 只 是 在 43°C 水浴的条件下每管加入300/xl 琼 脂 糖 （步 骤 4)。然 后 准 备 玻 璃 管 （步 骤 5)，但 不 是 将 50]ul T N P -S R B C 分配到管中 (步骤5)，而是加入30〜4〇 4蛋白质A - SRBC (即作为靶细胞使用）。加 人 50/^1 (凭经 验决定）稀 释 的 兔 抗 I g M 、 I g G 或 I g A 同种型。检 测 玻 片 （步 骤 5)，颜色应为淡红。 再 加 人 细 胞 （步 骤 6)，但是只使用10〜20/xl来源于洗涤过的细胞板中的细胞，因为多 克隆反应通常比抗原特异性的反应强。完 成 剩 余 的 步 骤 （见基本方案2 , 步 骤 6〜16)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469497214183qbe8q7qa9zpng_small.jpg)
辅 助 方 案 1 制备琼脂糖包被的玻片
材 料
7 0 % 乙 醇
SeaPlaque 低 熔 点 琼 脂 糖（F M C Bioproducts)
一端磨砂的载玻片（如 Gold Seal Rite-O N 载玻片， Fisher)
玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher)
烤箱
IOOml 玻璃瓶
43°C 水浴
载玻片盘
![涂 料 刷 （可选） 玻片盒 1 . 将一端磨砂的载玻片放在玻片盒上。将它转移至含7 0 % 乙醇的染色缸中浸泡。移出 架子在烤箱内放置IOmin使玻片干燥。将玻片冷却至室温。 2 . 在 IOOml玻璃瓶中制备1.6% (m /V ) 低 熔 点 琼 脂 糖 溶 液 （每 20m l 水 里 加 入 0.32g 琼脂糖）并摇晃。 3 . 用微波炉加热玻璃瓶，使琼脂糖沸腾20s 以确保所有琼脂糖都溶解。将琼脂糖瓶放 在 43°C 水浴中。 4 . 将玻片放在玻片盒上，磨砂的一面向上。 5a. 用 涂 料 刷 制 备 玻 片 ：用 21.3m l 温 水 稀 释 2. O m l 的 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) 制备 0 . 15%琼脂糖。用涂料刷将0 . 1 5 % 的琼脂糖包被在玻片上，将玻片放于玻片盒中。 5b. 通过浸没制备玻片：将 玻 片 放 在 玻 片 盒 内 ，浸 泡 至 含 200ml 0 . 1 5 % 琼 脂 糖 [即 181. 25m l 温水中含18. 75ml 1 . 6 % 琼 脂 糖 （步 骤 2 ) ] 的染色缸中lmin。 6 . 在干烤箱内干燥玻片至少60min。将玻片冷却并保持在玻片盒里。包被的玻片可以 在室温中保存几个月](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469497235977cs2g3yvizipng_small.jpg)
辅 助 方 案 2 制 备 Cunningham-Szenberg 小室
材料
7 0 % 乙醇
3inX I in X 0.93〜 1.05 mm 载玻片
玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher)
干烤箱
0.25in 双 面 胶（如 3M )
滚 筒（如 25m l 移液管或者类似的圆形物体）
1.将 3in X l in X 0. 93〜 1.05m m 载玻片放于玻片架上。将 它 转 移 至 含 7 0 % 乙醇的染色缸内浸泡。移出玻片架将玻片在干烤箱内干燥 l 〇 m in。 然后使玻片冷却至室温。
2.将 15〜3 0 个玻片靠近排放，但是互相不接触。
3.将 0. 25in 双面胶贴于玻片两端和玻片的中间使得玻片被分成了两个 100/xl 部 分（图2. 5. 2A )
4.撕开双面胶的背面，将另一个玻片对齐粘上。
5.用滚筒轻轻地压玻片以使双面胶贴牢。使用的时候用刀片裂开玻片之间的胶带。
辅 助 方 案 3 三 硝 基 苯 半 抗 原（TNP) 偶 联 SRBC
材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)
双 甘 氨 肽（改良的巴比妥缓冲液）
l X M B B
2 ，4,6-三 硝 基 苯 磺 酸（T N B S ) ，钠盐
O .28mol/L 二甲砷酸盐缓冲液， p H 6. 9
辅 助 方 案 4 蛋 白 质 A 偶 联 SRBC
材 料
![3 . 将 13. 3mg氯化铬溶解在IOml生理盐水里制备新鲜的IOX氯化铬储存液。 1 •• 10稀 释 成 I X 溶液。向蛋白质A 和 SR B C 混 合 物 中 （步 骤 2 ) 逐 滴 加 入 5. Oml I X 氯化铬 (III) 并不停轻摇离心管。在摇床上轻微摇动并于室温培养lh。 4 . 将离心管充满生理盐水， 4°C ， 80(^离 心 5min。 用 15m l生理盐水通过离心洗涤蛋白 质 A 偶 联 的 SR B C 两次后用生理盐水重悬至终浓度1 5 % 如果在偶联之前 或之后甚至3 次洗涤的上清都呈红色或淡红色，则应丢弃该SRBC， 重新使用新鲜的 (不超过几周） SRBC。 蛋 白 质 A -S R B C 可以保存在4°C 长 达 48h 。 辅 助 方 案 5 制 备 TNundefined ■卵白蛋白 此方法可用于将T N P 家族偶联至多种其他蛋白质，包 括 K L H 、 B S A 及人或牛免 疫球蛋白7 。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 卵 白 蛋 白 （Sigma-Aldrich) V 〇 .l m 〇l/L 碳酸氢钠溶液 T N B S I X 生理盐水 锡箔纸 注意：本单元的计算假定l .O m g /m l卵 白 蛋 白 的 O D 28。为 0.587, T N B S 的摩尔消 光系数为 1. 25 X IO 4N T 1 • cm — \ 1 . 用 L O m l 的 0. lmol/L 碳酸氢钠溶液溶解20m g 的 卵 白 蛋 白 （43 000g/mol)。 2 . 用 L O m l 水溶解 15m g T N B S (293g/mol) 制备 51.2mmol/L 溶液。 3 . 向 2.5m l卵 白 蛋 白 溶 液 （步 骤 1 ) 缓慢加入0.317ml T N B S 溶液并不断搅拌使TNBS 比卵白蛋白多13倍 。覆盖锡箔纸，轻轻摇荡4°C 过夜使反应发生。 4 . 用 2L 盐水透析反应物5 遍 。 5 . 测 定 O D 28q和 O D 34 q 。校 正 O D 28。得 出 T N P 族的吸光率： O D 28。校正= O D 280- O.337X O D 340 6 . 用每毫升的毫克数计算卵白蛋白的浓度： 卵 白 蛋 白 （m g /ml) = O D 28 q校正/0.587 7 . 用每升的摩尔数计算卵白蛋白的浓度： [卵 白 蛋 白 ]= 卵 白 蛋 白 （m g /ml) /43 000 8 . 用 mol/L 计 算 T N P 的浓度： [TN P] = O D 340A .25 X IO 4 9 . 计 算 T N P 和卵白蛋白的比率： T N P /卵 白 蛋 白 =摩 尔 TN P /摩尔卵白蛋白](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469497302616jj2niz9kp8png_small.jpg)
辅 助 方 案 6 用 Percoll 梯度离 心纯 化 静息 B 细胞
材料
IX 和 IOX Hanks 平 衡 盐 溶 液（H B S S ) ，不 含 镁（Life Technologies)， 4°C
来源：丁香实验
