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        IL-1的体外诱生

        互联网

        3030
        IL-1 的体外诱生
         
            IL-1主要由活化的单核/巨噬细胞产生,具有广泛的生物学活性。IL-1包括IL-1α和IL-1β,两者分子量相近,且均能与IL-1R结合,故具有相似的生物学活性,常用的IL-1生物活性检测法对两者均适用。常用的IL-1生物活性检测法包括:小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法等。这些方法均不能区分IL-1α与IL-1β,只能用免疫学检测法才能加以区分。由于体液中IL-1含量极少,难以直接测定,故通常是通过检测体外诱生的IL-1来反映体内IL-1活性水平。
        【基本原理】
         LPS是IL-1α与IL-1β的诱生物,能在体外诱导单核/巨噬细胞产生IL-1α与IL-1β。下面重点介绍以小鼠腹腔巨噬细胞活性制备IL-1。
        【材料和试剂】
        (1)     BALB/c或C57BL/6小鼠:6-10周龄,雌雄均可。
        (2)     75%酒精
        (3)     LPS:10% FCS-RPMI-1640培养液配制成10μg/ml。
        (4)     5% FCS-HBSS(Hanks液),10% FCS-RPMI-1640培养液。
        (5)     带9号针头的无菌注射器(5ml以上),刻度吸管,毛细吸管,刻度离心管,加样器(头),24孔细胞培养板,温浴箱,细胞计数板,例显微镜,离心机,超净工作台,CO2 培养箱等,0.22μm滤膜及滤器
        【操作步骤】
        (1)     将BALB/C或C57BL/6小鼠拉颈处死后,浸泡入75%酒精中3~5min,消毒处理;
        (2)     用带9号针头的无菌注射器向小鼠腹腔内注入5ml冷的5% FCS-HBSS,用消毒拇指轻揉腹部数次后,吸回腹腔液体(内含腹腔细胞及巨噬细胞),反复抽吸几次;
        (3)     置刻度离心管中,以1500r/min离心8min,并用5% FCS-HBSS洗涤细胞2次;
        (4)     将腹腔细胞用10% FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×106 /ml;
        (5)     将上述细胞悬液加至24孔平底培养板中,1ml/孔,置37℃,5%CO2 培养箱中孵育2h ;
        (6)     用5% FCS-HBSS洗板3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层;
        (7)     将LPS(10μg/ml)加入巨噬细胞单层,1ml/孔,置37℃,5% CO2 培养箱中培养4h;
        (8)     再加入10% FCS-RPMI-1640培养液,1ml/孔,37℃,5%CO2 培养箱中培养至48h;
        (9)     收集细胞培养上清液,即为含IL-1的待测样品,用0.22μm滤膜过滤除菌后,分装后置-20℃或-70℃冰箱中,待测IL-1活性。
        【注意事项】
        (1)     一般一只小鼠腹腔液可获腹腔细胞3~5×106 ,能满足诱生IL-1所需细胞数,所获细胞存活率应>95%。
        (2)     若要测定人IL-1的生物活性,可参见本书第六章,分离出外周血单核巨噬细胞,用LPS刺激即可(同上述)。
        (3)     IL-1诱生剂的浓度、细胞浓度和培养条件对结果有明显影响,应进行预试验,以确定最佳诱生条件。操作时接触细胞的试剂或器皿应无致热原,例如使用的的耐热器皿可以通过180℃干烤2.5小时。
        (4)     操作过程均应无菌,否则会影响IL-I诱生及活性测定。
        (5)     所获细胞培养上清液在分装冻存前宜过滤除菌及杂质。
        (6)     培养材料:24孔培养板培养细胞存活率高,但生长稍慢;玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净而导致培养细胞死亡,故应采取相应措施。大容量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作过程中的污染。
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