IL-1的体外诱生
互联网
3053
IL-1 的体外诱生
IL-1主要由活化的单核/巨噬细胞产生，具有广泛的生物学活性。IL-1包括IL-1α和IL-1β，两者分子量相近，且均能与IL-1R结合，故具有相似的生物学活性，常用的IL-1生物活性检测法对两者均适用。常用的IL-1生物活性检测法包括：小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法等。这些方法均不能区分IL-1α与IL-1β，只能用免疫学检测法才能加以区分。由于体液中IL-1含量极少，难以直接测定，故通常是通过检测体外诱生的IL-1来反映体内IL-1活性水平。
【基本原理】
LPS是IL-1α与IL-1β的诱生物，能在体外诱导单核/巨噬细胞产生IL-1α与IL-1β。下面重点介绍以小鼠腹腔巨噬细胞活性制备IL-1。
【材料和试剂】
（1） BALB/c或C57BL/6小鼠：6-10周龄，雌雄均可。
（2） 75%酒精
（3） LPS：10% FCS-RPMI-1640培养液配制成10μg/ml。
（4） 5% FCS-HBSS（Hanks液），10% FCS-RPMI-1640培养液。
（5） 带9号针头的无菌注射器（5ml以上），刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管，加样器（头），24孔细胞培养板，温浴箱，细胞计数板，例显微镜，离心机，超净工作台，CO2 培养箱等，0.22μm滤膜及滤器
【操作步骤】
（1） 将BALB/C或C57BL/6小鼠拉颈处死后，浸泡入75%酒精中3~5min，消毒处理；
（2） 用带9号针头的无菌注射器向小鼠腹腔内注入5ml冷的5% FCS-HBSS，用消毒拇指轻揉腹部数次后，吸回腹腔液体（内含腹腔细胞及巨噬细胞），反复抽吸几次；
（3） 置刻度离心管中，以1500r/min离心8min，并用5% FCS-HBSS洗涤细胞2次；
（4） 将腹腔细胞用10% FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×106 /ml；
（5） 将上述细胞悬液加至24孔平底培养板中，1ml/孔，置37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h ；
（6） 用5% FCS-HBSS洗板3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层；
（7） 将LPS（10μg/ml）加入巨噬细胞单层，1ml/孔，置37℃，5% CO2 培养箱中培养4h；
（8） 再加入10% FCS-RPMI-1640培养液，１ml/孔，37℃，5%CO2 培养箱中培养至48h；
（9） 收集细胞培养上清液，即为含IL-1的待测样品，用0.22μm滤膜过滤除菌后，分装后置-20℃或-70℃冰箱中，待测IL-1活性。
【注意事项】
（1） 一般一只小鼠腹腔液可获腹腔细胞3~5×106 ，能满足诱生IL-1所需细胞数，所获细胞存活率应>95%。
（2） 若要测定人IL-1的生物活性，可参见本书第六章，分离出外周血单核巨噬细胞，用LPS刺激即可（同上述）。
（3） IL-1诱生剂的浓度、细胞浓度和培养条件对结果有明显影响，应进行预试验，以确定最佳诱生条件。操作时接触细胞的试剂或器皿应无致热原，例如使用的的耐热器皿可以通过180℃干烤2.5小时。
（4） 操作过程均应无菌，否则会影响IL-I诱生及活性测定。
（5） 所获细胞培养上清液在分装冻存前宜过滤除菌及杂质。
（6） 培养材料：24孔培养板培养细胞存活率高，但生长稍慢；玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净而导致培养细胞死亡，故应采取相应措施。大容量培养时用大容量瓶比较方便，可减少操作过程中的污染。
