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        PriCells: 从人关节软骨中分离软骨祖细胞

        互联网

        3310

        试剂和材料:

        1. 骨关节炎患者行膝盖关节半切开手术时未累及的部分;

        2. 链霉蛋白酶消化培养基:DMEM/F12(1:1)、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素(50mg/ml),0.2%(终浓度100μg/ml)、链霉蛋白酶 70U/ml、HEPES 10mmol/L;

        3. 胶原酶消化培养基:DMEM/F12(1:1)、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素(50mg/ml),0.2%(终浓度100μg/ml)、Ⅰ型胶原酶 300U/ml、HEPES 10mmol/L;

        4. 胰蛋白酶/EDTA:胰蛋白酶(0.05%)和EDTA(0.53mmol/L)PBSA配制;

        5. PBSC:含1mmol/L CaCl2,1mmol/L MgCl2的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液;

        6. PBSA:无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液;

        7. 胎牛血清;

        8. 牛血清白蛋白(BSA),10μg/ml和1mg/ml,PBSC配制;

        9. 血清纤连蛋白,10μg/ml,PBSC配制;

        10. 尼龙膜,40μm筛网;

        11. 普通器皿,30ml,或离心管50ml,带圆锥底部便于细胞离心;

        12. 解剖刀片,10号;

        13. 解剖刀柄,3号;

        14. 镊子,2对(1大1小);

        15. 矿油凝胶(凡士林);

        16. 克隆杯,6mm;

        17. 分离软骨用的锁子甲手套;

        实验方法:

        1. 组织收集和细胞分离;

        (1) 无菌条件下,用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中;

        (2) 用镊子和刀片仔细将软骨切成1mm3小块;

        (3) 将软骨小块转移至含18ml链酶蛋白消化培养基的普通器皿或离心管中;

        (4) 置于滚转机37℃处理1h;

        (5) 吸出消化液弃之;

        (6) 加入18ml胶原酶消化培养基,再次置于滚转机37℃处理1h;

        (7) 40μm细胞滤网过滤;

        (8) 用血细胞计数板进行细胞计数;

        (9) 加入黏附测定培养基,620g离心10min进行洗涤,用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞(4000个细胞);

        2. 差异黏附测定;

        (1) 用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿,4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA;

        (2) 吸出液体,用含1mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min;

        (3) 加入2ml培养基重悬的细胞悬液静置20min;

        (4) 吸出培养基和未贴壁细胞,置于第二个培养皿中20min;

        (5) 向第一个培养皿中加入2ml生长培养基后置于孵箱;

        (6) 从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中;

        (7) 向第二个培养皿中加入2ml生长配演技后置于孵箱;

        (8) 向最后一个培养皿中加入200μl FBS后置于孵箱;

        (9) 3h后,用相差显微镜计数最初贴壁的细胞;

        (10) 培养细胞,至明显可见多于32个细胞的集落,一般需要10天;

        3. 集落扩增;

        (1) 用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落,在培养皿下用记号笔将其画圈标记;

        (2) 计数和记录每个集落的细胞数量;

        (3) 从Petri培养皿中吸出培养基,用PBSA润洗;

        (4) 在克隆环上无菌涂抹凡士林,或者使用无菌镊子直接将其浸入凡士林;

        (5) 将克隆环置于集落上,向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液,静置5—10min——相差显微镜观察细胞已脱落;

        (6) 重悬细胞,置于Eppendorf管中,300g离心5min;

        (7) 生长培养基洗涤,重复上述离心;

        (8) 生长培养基稀释,12孔板中每孔接种1个集落;

        (9) 细胞汇合时,接种至3.5cm培养皿(或6孔板),然后再移至较大培养瓶;


         

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