• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        从人关节软骨中分离软骨祖细胞

        相关实验:从正常人和骨关节炎患者的关节软骨中分离软骨祖细胞实验

        最新修订时间:

        原理



        材料与仪器

        步骤

        A.组织收集和细胞分离


        (a)无菌条件下,用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨(见本方案后的注解1)。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中。


        (b)用镊子和刀片仔细将软骨切成1 mm3小块。


        (C)将软骨小块转移至含18 mL链霉蛋白酶消化培养基的普通器皿或离心管中。


        (d)置于滚转机37℃处理1 h。


        (e)吸出消化液弃之。


        (f)加人18 ml胶原酶消化培养基,再次置于滚转机37℃处理1 h。


        (g)细胞滤网过滤,,


        (h)用血细胞计数板进行细胞计数。


        (i)加人黏附测定培养基,620g离心10 min进行洗涤,用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞(4000个细胞)。


        B.差异黏附测定


        (a)用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿,4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA。


        (b)吸出液体,用含1 mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min。


        (c)加人2 ml培养基重悬的细胞悬液静置20 min。


        (d)吸出培养基和未贴壁细胞,置于第二个培养皿中20 min。


        (e)向第一个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于鮮箱。


        (f)从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中。


        (g)向第二个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于孵箱。


        (h)向最后一个培养皿中加人200μl FBS后置于孵箱。


        (i)3 h后,用相差显微镜计数最初贴壁的细胞。


        (j)培养细胞,至明显可见多于32个细胞的集落(见注解2),一般需10天。


        (k)用以下公式计算集落形成率(GFE):


        CFF=χ天的集落数/0天贴壁细胞的细胞数


        集落扩增


        (a)用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落,在培养皿下用记号笔将其画圈标记(见注解4)


        (b)计数和记录每个集落的细胞数


        (C)从Petri培养皿中吸出培养基,用PBSA润洗。


        (d)在克隆环上无菌涂抹凡士林,或者使用无菌镊子直接将其浸人凡士林


        (e)将克隆环置于集落上(见注解5),向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液5〜10 min—相差显微镜观察细胞已脱离。


        (f)重悬细胞,置于Eppendorf管中,300g离心5min(见注解6)


        (g)生长培养基洗涤,重复上述离心。


        (h)生长培养基稀释,12孔板中每孔接种1个集落。


        (i)细胞汇合时接种至3.5cm培养皿(或6孔板),然后再移至较大培养瓶25cm2,75cm2最后为175cm2

        常见问题

        注解:


        解剖小块软骨或单个髁状突时,解剖过程巾用大镊子抓牢将其固定,如果解剖整个骨髁,戴好领子甲手套(乙醇清洗)固定关节。软骨很滑,并且髁状突呈弯曲状,很容易割伤自己!表面滴加灭菌PBSA可保持软骨湿润。


        择大于32个细胞的集落,需注意避免选择可形成过渡放大群的细胞(祖细胞的直接后代),它们正常可扩增5个群体细胞倍数(PDs)。'


        ⑶可以通过实验观察和借助显微镜等一系列方法标记集落,例如,通过物鏡放大后进行标记。有些人直接将克隆环放在集落上,在层流通风橱中使用显微镜。标记圈应适合倒置显微镜的物镜转换盘,可从Nikon获得。


        (4)如果需要精确判定细胞所经过的集落扩增倍数,计数每个集落中的细胞尤为重要。


        (5)确保要标记的集落间有足够的空间以避免污染;或者可能的话将克隆环缩小


        (6)如果使用较小的克隆(35〜50个细胞),Eppendorf洗涤的步驟可以省略,将带有胰蛋白酶/EDTA的细胞直接转移到12孔板中,所含的2 ml生长培养基足够中和


        (7)软骨的细胞外基质均随年龄增多。所以,消化时间随着供者的年龄有所变化,年轻供者的组织较短的时间即可完全消化。应切记尽量缩短使细胞脱落的消化时间以保证最大的细胞存活率。在胶原酶中以小时间隔进行急剧搅拌可加速组织溶解过程。作为指导,每克软骨中至少加7 ml消化液,超过此体积无妨但浪费试剂。如果是年龄很小的供者,参考以下的胎儿软骨操作步骤。


        (8)克隆细胞系转移至6孔板或3.5cm petri培养皿,生长良好时,几天内可汇合,按1:2稀释度传代。更大比例的稀释(1:4或1:8)可应用于更成熟的培养物。


        (9)使用胶原酶时单位活性很重要,因为不同批次间可相差3倍。建议做批次试验。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序