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        感受态细胞制备实验

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        10379

        一、CaCl2 感受态细胞的制备的实验步骤

        1.前夜接种受体菌( DH5α或 DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时);

        2.取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm);

        3.将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷;

        以下步骤需在超净工作台和冰上操作

        4.吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;

        5.4℃下3000g冷冻离心5分钟;

        6.弃去上清,加入 100μl预冷0.1M CaCl2 溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟;

        7.4℃下3000g冷冻离心5分钟;

        8.弃去上清,加入 100μl预冷0.1M CaCl2 溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

        9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂( 15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(-70℃)。

        二、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

        1.前夜接种受体菌( DH5α或 DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜;

        2.取 2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600 =0.6(约2.5-3小时);

        3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

        4.吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;

        5.4℃下3000g冷冻离心5分钟;

        6.弃去上清,加入 1500μl冰冷的10%甘油,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

        7.4℃下3000g冷冻离心5分钟

        8.弃去上清,加入 750μl冰冷的10%甘油,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

        9.4℃下3000g冷冻离心5分钟

        10.加入 20μl冰冷10%的甘油,用移液器轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

        11.立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。

        附注:

        影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项:

        1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600 来控制。DH5α菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5 × 107 /ml );

        2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行;

        3.经 CaCl2 处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);

        4.化合物及无机离子的影响:在 Ca2+ 的基础上联合其他二价金属离子(如 Mn2+ 或 Co2+ )、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高( 100-1000 倍);

        5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;

        6.质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ;

        7.一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比。

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