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        蛋白质纯化之离子交换法

        互联网

        5853

        一、仪器设备

        1.塑料管柱(Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

        2.部分收集器(fraction collector, 另需准备干净试管约60 支)

        3.浓缩用离心机(低速5,000 rpm)及浓缩离心管Centriplus

        二、药品试剂

        1.DEAE Sephacel (胶体体积约15 mL,预先以缓冲液Buffer A-0 平衡好)

        2.Buffer A-0

        3.Buffer A-300 溶离液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

        4.Buffer A-500 溶离液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

        三、方法步骤

        1.将Econo-Pac 管柱架好,并将三向阀及软管等组合完成。

        2.震荡DEAE Sephacel 胶体使其悬浮,小心倒入管柱中,让胶体慢慢沉降,在沉降过程中随时加入buffer A-0,勿使胶体干掉。

        3.待胶体沉降完全后,高度应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考虑;连接好收集器,每试管收2.5 mL。离子交换法的胶体平衡极为重要,可测流出液的pH 或离子浓度,看是否与buffer A-0 相同,若不一样则需要再流洗的。

        4.样本的添加方法同上述胶体过滤法,并启动部分收集器开始收集,当样本全部没入胶体后,再加入同体积buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后,去除胶体上方的缓冲液,但勿使胶体干掉。

        5.然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的,每批次流洗各50 mL,注意更换浓度时,胶体上方勿残存上一种溶液。

        6.收集所有分划,进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定,结果作图。

        7.收集GUS 活性区,并以Centriprep-30 浓缩至 _______ mL (IEX),记得要保留100 μL。

        8.离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后,收起来交回。
         

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