真核细胞DNA的制备与定量

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

一、试剂准备

1、TE: 10mM Tris-HCl （pH 7.8）； 1mM EDTA （pH 8.0）。

2、TBS: 25mM Tris-HCl （pH 7.4）； 200mM NaCl; 5mM KCl.

3、裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100 g/ml.

4、20% SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

二、操作步骤

（一）材料处理

1、新鲜或冰冻组织处理：

⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。

⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

⑶ 加20% SDS 25  l，蛋白酶K （2mg/ml） 25  l,混匀。

⑷ 60 C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

⑵ 离心4000g×5min,去除上清液。

⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。

⑷ 50-55 C水浴1-2hr.

（二）DNA提取

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min.

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min,弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100 ul TE溶解过夜。

（三）DNA定量和电泳检测

1、DNA定量：

DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD260/OD230的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

2、电泳检测：

取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。

三、注意事项

1、所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。

2、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

3、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

4、用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。