石蜡包埋组织的DNA提取及其应用
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石蜡包埋组织的DNA提取及其应用
近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失、突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节 重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法
从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Gpelz 氏 DNA 提取方法的主要步骤：
1、切除多余石蜡，暴露组织；
2、将组织切碎（最大径 <0.5mm ），称重；
3、溶于 TE9 提取液（组织 <50mg/5ml,50 ～ 500mg/10ml ）, 高速混悬 2 ～ 3min；于 48 ℃ 放置 24h，其制备见表 18-6；
4、再次混悬组织，加入蛋白酶 K 至终浓度 1mg/ml,SDS 至 2% ，孵育 40h ；
5、用等体积酚 - 氯仿溶液抽提 3 次；
6、2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA；
7、-70℃ 放置 2 ～ 4h；
8、9000×g 离心 1h；
9、沉淀物用 70% 乙醇洗 1 次；
10、干燥， TE （ pH7.2 ）溶解。
TE9 DNA 提取液的制备
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Tris |
500mmol/L |
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EDTA |
20mmol/L |
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NaCl |
10mmoo/L |
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SDS |
1% |
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蛋白酶 K |
500μg/ml |
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PH |
8.0 |
实验步骤
1、5μm 组织切片；
2、常规脱蜡、水化；
3、第一次溶液 A 孵育（去上清）；
4、第二次溶液 A 孵育（留上清）；
5、氯仿 - 异戊醇抽提；
6、RNA 酶和蛋白酶消化；
7、酚抽提；
8、沉淀；
9、透析（却除未螺旋化 DNA ）。
