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        质粒DNA的大量制备

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        2088

        实验试剂

         

        1. STE
        0.1mol/L NaCl
        10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
        1mmol/L EDTA(pH8.0)

        2. 溶液Ｉ
        50mmol/L葡萄糖
        25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
        10mmol/L EDTA(pH8.0)
        溶液Ｉ可成批配制，在6.895x104 Pa高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。


        3. 溶菌酶溶液

        10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)


        4. 溶液Ⅱ
        0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
        1％SDS

        5. 溶液Ⅲ
        5mol/L乙酸钾 60ml
        冰乙酸 11.5ml
        水 28.5ml
        所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

        实验步骤

         

        1. 收获
           1) 用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
           2) 将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。

        2. 碱裂解法

           1) 将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于10ml溶液Ｉ中。

           2) 加1ml新配制的溶菌酶溶液。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。
           3) 加20ml新配制的溶液Ⅱ。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
           4) 加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。
           5) 用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
           6) 上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。
           7) 用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
           8) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
           9) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
          10) 纯化。

        3. 质粒DNA的纯化

           1) 将所得核酸溶液转入15mlCorex中，再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
           2) 将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钟，回收沉淀的核酸。
           3) 小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
           4) 用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE（pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。
           5) 加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。
           6) 吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
           7) 将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml)乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
           8) 吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
           9) 吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
           10) 用500μl TE（pH8.0)溶解沉淀1:100稀释后测量OD260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml)，然后将DNA贮于－20℃。

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