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        煮沸裂解法大量制备质粒DNA

        最新修订时间:

        原理

        经 Triton X-100、溶菌酶和加热处理可从大量(500 ml ) 细菌培养物中分离质粒 DNA,所获得的质粒通过柱层析或 CsCl-溴化乙锭梯度离心可进一步纯化。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        (1) 用于筛选质粒的抗生素

        (2) 氯霉素(34 mg/ml)

        (3) 乙醇

        (4) 异丙醇

        (5) STE

        (6) STET

        (7) TE ( pH 8.0 )

        2. 酶和缓冲液

        (1) 溶菌酶(10 mg/ml )

        (2) 限制性内切核酸酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶

        4. 培养基

        LB、YT 或 Terrific 培养液

        5. 离心机和转头

        Beckman SW41 Ti 转头或与之相当转头;Sorvall GSA 转头或与之相当转头;Sorvall SS-34 转头或与之相当转头。

        6. 特殊设备

        沸水浴、本生灯、纱布(4层)。

        二、方法

        1. 细胞的制备

        (1) 挑取转化细菌的单菌落或 0.1~1.0 ml 单菌落的培养物,接种到 30 ml 含适当抗生素的培养液(LB、YT 或 Terrific 培养液)中。

        为了确保培养物通气良好:试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍;试管不宜盖紧;培养过程中要在 250 r/min 下剧烈振摇。

        (2) 在适当的温度及摇速(250 r/min ) 下培养菌液直至对数生长期晚期(OD600 约为 0.6 )。

        (3) 在 2 L 的烧瓶中,将 25 ml 对数生长期晚期的菌液接种到含适当抗生素的 500 ml 的培养基(LB、YT 或 Terrific 培养液(预热到 37 ℃))中。将此培养基在 37℃ 剧烈振摇(250 r/min ) 条件下培养约 2.5 h。

        最后菌液的 OD 值应约为 0.4。不同菌株之间或同一菌株含的质粒的不同,细菌的生长速度各不相同。因此为了达到理想的光密度,培养时间可略微长于或短于 2.5 h。

        (4) 在培养液中添加 34 mg/ml 的氯霉素 2.5 ml,使其终浓度为 170 μg/ml。将此培养液于 37℃ 剧烈摇晃下继续以 250 r/min 培养12~16 h。

        (5) 取部分菌液(1~2 ml ) 到离心管中,4℃ 贮存备用。余下的菌液于 4℃ 以 2700 g ( 对于 Sorvall GSA 转头为 4100 r/min ) 离心 15 min 收获。弃上清,倒置离心管使残余的上清流尽。

        (6) 用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬细菌,按步骤 5 重新收集并将其贮存于 -20℃。

        (7) 将步骤 5 贮存的 1~2 ml 菌液按小量提取法抽提质粒。采用酶切和琼脂糖电泳分析此质粒,以确定大量培养的菌液中正确的质粒得以扩增。

        设置这种对照可能看上去有点过于谨慎,然而它可以避免发生某些可能难以挽回的、浪费大量时间的错误。

        (8) 将步骤 6 中冻存的细菌在室温下放置 5~10 min 使其解冻,然后用 10 ml 预冷的 STET 重悬。将重悬液转移到一个 50 ml 的 Erlenmeyer 烧瓶中。

        2. 细胞的裂解

        (1) 加入 1 ml 新配置的溶菌酶(10 mg/ml )。

        (2) 用夹子夹住 Erlemneyer 烧瓶,在本生灯的明火上烤至液体开始沸腾。在加热的过程中不停地摇动烧瓶。

        警惕:在加热过程中,不要让烧瓶的开口对着自己或实验室内的其他人。

        (3) 迅速将烧瓶的下半部浸入到一大烧杯(2L ) 内的沸水中。将烧瓶在沸水中准确放置 40 s。

        延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性(Vinograd and Lebowitz 1996),所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶切割,而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍,难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA。

        (4) 将烧瓶在冰水中放置 5 min,使之冷却。

        (5) 将烧瓶中黏稠的液体转移到超速离心管中(BeCkman SW41 管或与其相当的管),于 4℃ 以 150000 g ( 或 Beckman SW41  Ti 转头,30000 r/min ) 离心 30 min。

        起初的细菌培养物长得越密,在此步就越难将该黏稠状裂解物转移到离心管中。如有必要,可用长刃剪刀将裂解物剪成大小易于操作的团块,或过 10 ml 注射器使之部分切开。从经氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒 DNA 时,一般不会出现这一问题。

        (6) 将上清尽量转移到洁净离心管中,弃去原离心管中残留的黏荷液体。

        若细菌碎片未能形成紧密的团块,可以 210000 g(或 Bedtman SW41 Ti 转头,35000 r/min ) 再度离心 20 min,然后按上述方法转移上清。

        (7) ( 可选)若上清中含有可见的线状基因组染色质或絮状的蛋白质沉淀,在进行下面的处理之前可用四层纱布过滤(Huang and Campbell 1993)。

        3. 质粒 DNA 的回收

        (1) 测量上清的体积,将上清连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中,充分混匀,室温下放置 10 min。

        (2) 在室温下以 12000 g ( Sorvall GSA 转头为 10000 r/min ) 离心15 min,回收沉淀下来的核酸。

        若在 4℃ 下离心会使盐也沉淀下来。

        (3) 小心地弃去上清,将离心管敞开盖倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用 70% 的乙醇漂洗管底及管壁,倒掉乙醇,并用连于真空管的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上几分钟使剩余的乙醇挥发掉。此时沉淀应该仍然是湿的。

        (4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀。

        (5) 可用柱层析法、聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙锭梯度离心法纯化粗制的质粒 DNA。

        (6) 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。

        来源:丁香实验

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