互联网2013-11-13
1. 水稻RGA的搜索
搜集已报道的45个R基因，然后用它们对粳稻蛋白质数据库进行BLASTP (参数取E<10-10 ，最小长度为该基因的80%)，获得所有粳稻的RGA序列。去除粳稻数据库中存在的重复克隆，建立一个粳稻RGA蛋白数据库。同时，根据每个BLASTP搜索中匹配最好的结果，得到这些粳稻RGA的核普酸序列。此外，去除粳稻数据库中存在由于的克隆重复造成的R基因的重复。
2. 水稻RGA的结构分类及其在染色体上的分布
利用Hmmer程序中的hmmsearch部分，采用前面建立的功能域列表，在新建立的数据库中搜索基因序列所包含的功能域。利用pepcoil程序分析序列中CC结构的可能性，数值大于90%的认为具备该结构。运用TM-HMMer分析TM转膜功能域。依据功能域分布的情况，对RGA进行分类，分别统计各类RGA在不同染色体上的分布情况。
3. 两个亚种间RGA多态性的鉴定和开发
将所有粳稻的RGA序列分别与粕稻基因组数据库进行TBLASTN联配，以确定釉稻中对应的等位基因。为消除非等位联配，在TBLASTN搜索中采用了严格的判别标准，将E值设为10-20 。对初筛到的粕、粳稻RGA等位基因，进一步用sim4程序进行联配分析，去除匹配率≤85%且两条序列同时间断200bp以上的结果。接着运用diffseq程序分析SNP和InDel在RGA的基因组序列中的分布情况，将存在InDel的作为候选的RGA标记。以粳稻的基因组序列为模板，在INDEL位置的两侧各取100bp的序列，利用ePrimer3程序在取得的序列的两端进行引物设计。ePrimer3程序一般给出五对候选引物，我们取其设计最合理的一条(考虑到目标片段最大长度不大于1000bp)，并进行电子PCR(e-PCR)验证。对得到的水稻RGA标记进行命名，规则为以OSR开头，后跟4个数字，例如:OSR0255。上述步骤主要通过编写pert脚本程序来实现。
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