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        类器官的鉴定

        相关实验:🔥 类器官培养

        最新修订时间:

        材料与仪器

         基质胶,类器官培养基,移液器,CO2 培养箱

        步骤

        1.类器官收集

        (1)轻轻吸去培养基,各孔加入 500μl 凝胶消化液(以 24 孔培养板为例);

        (2)使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端,并用该枪头尖端将步骤(1)中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打,吹打时避免产生气泡,将胶滴吹散,放入冰盒上消化 20 min;

        Tips:

        1. 建议尽可能将胶滴吹散,避免影响消化效率。
        2. 使用移液器吹打时,应避免移液枪头尖端接触到皿底。

        (3)固定:弃去上层培养基,向类器官沉淀中加入1ml 4% 多聚甲醛(PFA),充分混匀,置于冰上或者 4℃ 静置固定 1h;

        (4)轻轻吸去固定液,向类器官沉淀中加入 D-PBS,使用枪头轻轻吹打混匀,静置 2~10min;小心吸去上清,重复步骤(4)清洗 2 次;

        (5)待类器官自然沉降后弃去上清,仅保留类器官沉淀,用 70%乙醇悬浮,4℃ 保存(注意:类器官可在 4℃ 中保存数周)。

         

        2.类器官包埋和切片

        (1)类器官包埋固定:使用 50 μl 完全溶解的 3% 的琼脂糖溶液重悬类器官沉淀,并转移至 5ml 离心管中,冰上放置 30min,待其凝固。

        注意:加热溶解琼脂糖时应避免琼脂糖溶液沸腾,否则会导致液体损失及浓度改变。

        (2)取出已凝固的包含有类器官沉淀的琼脂糖块,在梯度乙醇中脱水,70%、80%、90%、95%乙醇各 1h,无水乙醇 30min 两次,脱水过程需置于低速水平摇床上进行。

        (3)将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒(无水乙醇浸泡)中,将包埋盒转移至二甲苯中 5min 处理两次;

        注意:每次取出时尽量沥尽残留二甲苯。二甲苯有毒性,此步骤须在通风良好区域进行。

        (4)处理完成后立即转入已融化的蜡缸中,60℃ 石蜡浸透类器官 2h,换新蜡缸再浸 2h;

        (5)将组织包埋盒、模具转移至包埋机的左右保存盒中。取出模具先滴入20%~30%左右石蜡,再将琼脂块放入金属模具中间位置滴蜡包埋,组织包埋盒拆开扣于顶部。

        (6)包埋完成后置于冷冻台,待完全凝固后,小心脱下模具。

        (7)将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成薄片,一般为 5~8μm 厚 。

        (8)将切好的切片放入摊片机,需等待至蜡片完全展开,单层无褶皱。贴到载玻片上,放于 45℃ 恒温箱中烘干。

        (9)依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ5min、无水乙醇Ⅰ  5min、无水乙醇 Ⅱ 5min、95% 乙醇 5min、90% 乙醇 5min、80% 乙醇 5min、70% 乙醇 5min、蒸馏水洗 2 次。

         

        3.类器官 H&E 染色

        (1)苏木精染细胞核:切片浸入苏木精染 3~8min,自来水清洗,蒸馏水洗数秒;

        (2)伊红染细胞质:切片浸入伊红染液中染色 1~3min,自来水清洗,蒸馏水洗数秒;

        (3)脱水封片:将切片依次放入 95% 乙醇 I  5min 、95% 乙醇 Ⅱ 5min、无水乙醇 I  5min、无水乙醇 II  5min 、二甲苯   I  5min 、二甲苯 II  5min 中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,滴中性树胶封片;

        (4)镜检:显微镜镜下观察,图像采集分析。

         

        4.类器官免疫染色

        (1)抗原修复:用 0.01M 柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)充分浸泡样本,微波炉中低火加热修复,保持微沸状态 5 min 效果最好;

        (2)封闭:封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同,将非特异性位点结合掉,从而保证后续荧光染色的特异性。

        (4)一抗孵育:用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例,样本加一抗 4℃ 孵育过夜。

        (5)一抗洗脱:用 D-PBS 洗脱三次,每次 5min;

        (6)荧光二抗:用抗体稀释液稀释荧光二抗,样本加二抗室温孵育 2 h,注意避光;

        (7)二抗洗脱:用 D-PBS 洗脱三次,每次 5min;

        (8)封片:用含防淬灭的中性树胶进行封片,按需可以对细胞核用 DAPI 进行染色;

        (9)拍片:晾干片子后,置于显微镜下观察,获取荧光图像。

         

        5.类器官RNA测序分析

        转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的纽带,转录组信息帮助科学家们揭示组织器官发育调控和胁迫适应机制、生物进化规律、疾病发生发展的重要机制以及发现致病基因调控的关键靶点。对类器官进行 RNA 测序能够评估类器官与其源组织/肿瘤基因表达谱的一致性,即这些类器官能否很好地反映其源组织/肿瘤的遗传背景、基因型和表达谱。

         

        类器官测序前样本处理

        (1)轻轻吸去培养基,各孔加入等体积基础培养基。用枪头(用 Rinsing Solution 润洗后剪去尖端)将胶滴轻轻从皿底刮除;

        (2)将所有悬液转移到 1.5ml EP 管中, 用移液枪吹打 10 次,然后 4℃ 条件下 rcf 300g 离心 5min,此时会观察到离心管底部的类器官沉淀层,中间基质胶层以及培养基上清, 小心去除培养基上清与基质胶层;

        (3)加入 D-PBS,4℃ 条件下 rcf 300g 离心 5min;重复此步骤三次,彻底清洗类器官;

        (4)样本处理完成后,送样给第三方测序公司完成测序。

        来源:丁香实验

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