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土壤微生物总DNA提取及纯化

互联网2013-11-13

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实验试剂

TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂ HPO₄ , 2 mmol/L KH₂ PO₄ , pH 7.4)

DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃ PO₄ , 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)

蛋白酶K(25 mg/mL)

溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)

QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)

实验设备

50mL、1.5 mL离心管

高速离心机

实验材料

实验步骤

1. 总DNA提取：

(1) 取2 g土样，置于50mL灭菌的离心管中；

(2) 加入10 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；

(3) 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；

(4) 用5 mL PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂ HPO₄ , 2 mmol/L KH₂ PO₄ , pH 7.4)漂洗一次；

(5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃ PO₄ , 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混匀后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37℃水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；

(6) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；

(7) 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次；

(8) 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀过夜；

(9) 11 000 r/min 4℃离心20 min收集DNA沉淀；

(10) 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μL ddH₂ O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，转入1.5 mL离心管。

2. 总DNA纯化：

(1) 配制0.8%琼脂糖凝胶；

(2) 每个上样孔加入50 μL粗DNA，进行低电压长时间电泳(4℃, 25 V, 8 h)；

(3) 电泳结束后，切下主带所在的凝胶(胶的体积尽可能小)；

QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收：加入3倍体积的Buffer QXⅠ及适量的QIAXⅡ(Glassmilk)，55℃温浴10 min，每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀(回收大片段时不要涡旋)，待凝胶完全溶解，12 000 g离心1 min，弃上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶；再用500 μL Buffer PE洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH₂ O，离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。

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