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        酸性α醋酸萘酯酶染色法

        互联网

        5020

        实验原理

         

        淋巴细胞内含有许多种酶,如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异,如淋巴母细胞富含ACP,而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性,因此可利用化学反应作检测。T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthyl acetate esterase,ANAE),在弱酸性条件下,能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚,后者与六偶氮副品红偶联,生成不溶性的红色沉淀物,沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位,经甲基绿复染,反应呈现单一或散在的颗粒或斑块,显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外,单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应,应当注意区分。

        实验试剂

         

        1. 25%戊二醛溶液(固定液)  在0.1mol/L pH值7.4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml混和,置4℃冰箱保存备用。

        2. 副品红液  将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中,37℃溶解过滤,4℃冰箱保存备用。
        3. 4%亚硝酸钠溶液  取亚硝酸钠400mg,溶于蒸馏水10ml中,临用前配制。

        4. 六偶氮副品红溶液  取新配制的亚硝酸钠溶液3ml,慢慢滴入副品红溶液3ml中,边滴边搅拌,此时有刺激性气体产生。充分混合,1min后备用。

        5. α醋酸萘酯溶液:

           α醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。

        6. 0.067(1/15)mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液:

           甲液  KH2 PO4 9.08g加蒸馏水至1,000ml

           乙液  Na2 HPO4 9.74g加蒸馏水至1,000ml。(如为Na2 HPO4 •12H2 O则称取23.22g)

        取甲液13ml,加入乙液87ml,即为0.067mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液。

        7. 反应液

           0.067mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液89ml 六偶氮副品红 6ml(缓慢加入) α醋酸萘酯液25ml(缓慢加入)

        8. 甲基绿染色液充分混匀,调pH值5.8~6.0,临用前配制。

        甲基绿1g 蒸馏水100ml 置37℃溶解,冰箱保存备用。

        实验步骤

         

        1. 分离单个核细胞  取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank's液1ml,加入到含有2ml淋巴细胞分层液(比重1077±0001)的离心管中,以2 000 r/min离心30min。洗涤后,加少量Hanks液,摇匀。

        2. 制片  取上述细胞悬液1滴,加到洁净玻片上,涂片,自然干燥。

        3. 固定和染色  将制备的细胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min,流水冲洗,待干。将玻片置于反应液内,37℃孵育1h,取出用水冲洗,待干。

        4. 复染  用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色),水洗,吹干。油浸镜下观察计数。

        注意事项

         

        1. 不同质量的试剂,尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清晰程度等影响很大,应加注意。

        2. 由于本反应为酶化学反应,反应非常灵敏,各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值要求准确,需用精密pH试纸或pH计测定。

        3. 配制反应液时,各溶液混合,必须边摇边缓慢加入,若滴入过快,可出现沉淀,影响染色结果。

        4. 制片过程中,标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长,可影响酯酶活性。

        5. 涂片插入染色缸时,要注意必须将标本面与反应液接触,切勿将标本面紧贴缸壁,以免影响染色反应。如片子较多,反应液相对减少,会使阳性率减低。

        染色后冲洗不宜过久,防止酶反应产物的红色消减,造成标本观察困难。

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