分子杂交——Northern基因检测
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实验试剂
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
2．50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，高压灭菌。
4． 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7．1M Na2HPO4: Na2HPO4•12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4•2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
12. DEPC H2O: 1000ml ddH2O中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。实验步骤
4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。以1×甲醛凝胶电泳缓冲液为电泳液，电泳结束后转膜。
（1）．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
（3）．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
（6）．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
(7)．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
6. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1）取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
7.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交过夜。
8.杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
(3)1×SSC/0.1%SDS，42℃洗10min×2次。
10.压片：将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影一星期左右。
注意事项
