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酶联免疫吸附试验C1q测定法

互联网2013-11-13

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实验试剂

1. 免疫吸附剂系结合有IgG的纤维素。取纤维素(5%，pH值10.5)与溴化氰一起室温反应10min，用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH值8.0)充分洗涤。再与IgG一起于4℃下作用18h(20ml缓冲液中含3g纤维素和100mg IgG)。制备物用27mol/L甘氨酸缓冲液(pH值8.0)配成20%(W/V)悬液，贮于4℃。

2. 酶联C1q用戊二醛法将辣根过氧化物酶标记C1q，再经超滤AmiconXM200滤膜)分离贮于－20℃。

3. 其他试剂0.02mol/L TrisHCl缓冲液(pH值9.0)；0.2mol/L TrisHCl缓冲液(pH 值7.4)，以及含0.05%Tween20的同一缓冲液；0.2mol/L EDTA (pH值7.6)；酶底物溶液和中止液。

实验设备

聚苯乙烯反应板，酶联免疫检测仪。

实验步骤

1. 包被凝聚IgG取经0.02mol/L TrisHCl缓冲液(pH值9.0)透析过夜的凝聚IgG(100μg/ml)，加入聚苯乙烯板孔内，每孔100μl，37℃包被30min后，用缓冲液洗3次(第1次、第3次用0.2mol/L TrisHCl缓冲液(pH值7.4)；第2次用含0.05% Tween20的同一缓冲液)，真空干燥，贮于4℃。

2. 取血清标本50μl，加入0.2mol/L EDTA(pH值7.6)50μl，室温作用10min，使内源C1q游离，然后加入IgG免疫吸附剂500μl，室温振荡20min，再以500r/min离心5min，得到1∶10稀释的上清液。

3. 取已包被凝聚IgG的塑料反应板，每孔中加入上述上清液90μl，酶联C1q10μl(1∶100 ～200稀释液)，室温下反应20min，然后用含0.2mol/L NaCl，0.05%Tween20的0.2mol/L TrisHCl缓冲液(pH值7.4)洗3次，再加入100μl底物溶液(pH值6.0、0.1mol/L磷酸盐枸橼酸盐缓冲液50ml中，加入邻苯二胺20mg，30%(W/V)过氧化氢10μl)，室温放30min，加入2mol/L硫酸50μl中止反应，于492nm读取吸光值。如果定量，可用凝聚IgG制作标准曲线，测出免疫复合物的相对含量。

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