【讲座】精品文献讲座第一讲---三苯氧胺在子宫内膜癌的调节机制
丁香园论坛
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受斑竹的委托，首先代表中坚战友团感谢大家来免疫版做客，科研工作者就象在海边嬉戏的孩子，经常为能捡到一两块美丽的贝壳而欣喜。大自然是奥妙的，其中discover的过程,也是very funny.
文章题目：
Hypomethylation-linked activation of PAX2 mediates tamoxifen-stimulated
endometrial carcinogenesis
通讯作者：尚永丰教授
尚教授的这篇nature,思路也是独具匠心。
背景知识：三苯氧胺可以治疗乳腺癌，但是与子宫内膜癌呈正相关，这是为什么呢？大家觉得好奇，作者也很感兴趣。
实验目的：雌激素和雌激素受体（ERs,也是转录因子）结合调节靶基因的转录，三苯氧胺可以结合雌激素受体封闭这种作用，但是在子宫内膜癌，三苯氧胺的分子机制又是什么呢？
实验思路：
提出假说：既然雌激素和三苯氧胺都可以结合雌激素受体，并且都可以促进子宫内膜癌的发生，那么子宫内膜癌发生的效应分子极可能存在于受雌激素和三苯氧胺共同调控的靶基因当中。基于这种假说，他们试验证明三苯氧胺不仅影响雌激素相关靶基因的表达，而且调控一系列独特的基因表达，进而发现PAX2基因在介导雌激素和三苯氧胺刺激的子宫内膜细胞的增殖和癌变过程中起着关键作用。此外，他们还发现PAX2只在子宫内膜癌细胞中被雌激素和三苯氧胺激活表达，而在正常的子宫内膜上皮细胞中则不能被雌激素和三苯氧胺激活，这种差异是由于与癌症相关的PAX2基因启动子低甲基化造成的。
实验设计（括号内为实验的意义和感想）：
1． 确定基因芯片处理时间
子宫内膜癌上皮细胞Ⅰ期，Ⅱ期分别原代培养 预实验3小时产生最大量的雌激素受体的靶基因 确定处理时间（作者对实验细节是精益求精）
2． 分3组， 雌激素处理组， 三苯氧胺处理组，无因素干扰组（对照组）。每组都重复2次，每次做2次基因芯片（可见作者对科学的严谨）
结果：共同调节的35个基因（21个上调，14个下调）
3． 年龄相当的正常的子宫内膜上皮细胞同时重复上面的实验（这个平行对照很重要）
4． 结果
4.1 基因上调：
雌激素处理组：子宫内膜癌上皮细胞（42）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(33) 。
三苯氧胺处理组：子宫内膜癌上皮细胞（51）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(35)。
4.2 基因下调：
雌激素处理组：子宫内膜癌上皮细胞（55）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(62) 。
三苯氧胺处理组：子宫内膜癌上皮细胞（63）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(70)。
5． 6个与细胞生长与增殖相关的代表性靶基因通过RT-PCR进行证实
其中，EKLF, PKCa，PAX2是雌激素与三苯氧胺共同上调的靶基因，上调水平分别为高，中，低。
hKID, cyclin F ， RARb1是雌激素与三苯氧胺共同下调的靶基因，下调水平分别为高，中，低。
（作者在挑选基因时，是费了心思的，既有代表性，又避免过大的劳动量）
（作者从严格的基因芯片筛选和RT-PCR两种方法相互验证，结果非常可靠，佩服作者治学的严谨）
6． 这6个基因同时在正常的子宫内膜上皮细胞，通过基因芯片筛选和RT-PCR，除了PAX2，结果同样得到证实。同样的结果在无胸腺的雌性CD鼠的子宫组织也得到证实。雌激素与三苯氧胺对子宫内膜的增殖作用，通过称量处理鼠的湿重和腔上皮的厚度，以及细胞增殖的Marker,增殖细胞核抗原，上皮细胞的Marker，Ki-67的免疫组化来证实。
（靶基因的结果在细胞和组织都得到证实，结果非常可靠）
7. 子宫内膜癌细胞系ECC-1 ,Ishikawa转染携带21个上调基因的互补DNA的逆转录病毒,流式细胞仪分析细胞的增殖情况。结果显示细胞增殖（进一步确定靶分子的效应）。转入PAX2基因的细胞增殖明显，转入EKLF, PKCa基因的细胞也增殖。21个上调基因除去这3个基因的剩余基因转入细胞，细胞增殖不明显。蛋白的表达水平通过WESTERN或RT-PCR证实。（这个实验从正面说明PAX2可能是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）。
8． 用SiRNA沉默掉这21个上调基因，流式细胞仪分析细胞的增殖情况。用SiRNA沉默掉EKLF, PKCa基因，对细胞增殖的影响不大。用SiRNA沉默掉PAX2基因，细胞增殖明显减弱。21个上调基因除去这3个基因的剩余基因，用SiRNA沉默掉，对细胞增殖的影响最小。PAX2基因的突变体（活化区阻遏区被敲除），对PAX2介导的细胞增殖起负作用。这个负作用可以被野生型PAX2所抵消。基因表达的敲除，通过WESTERN或RT-PCR证实。（这个这个实验从反面说明PAX2可能是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）。
9． 同样对14个下调基因进行以上实验，正义和反义的转染，结果发现14个下调基因和细胞的增殖关系不大。（提示：对细胞增殖起关键作用的分子，不在这14个下调基因里）
10. 建立3种老鼠体内模型，PAX2无变化的（转入空载体），PAX2过表达的（转入PAX2正义载体），PAX2敲除的（转入PAX2反义载体）。每种老鼠体内模型又分若干组，每组分别用雌激素，三苯氧胺，无因素干扰等处理，结果与体外实验符合。转入EKLF基因，老鼠肿瘤生长与上面实验的对照组相似。（从体内实验证实， PAX2是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）
11．二元免疫荧光染色说明PAX2和ERa的着色部位近似。RT-PCR检测PAX2的表达水平和ERa的表达水平，统计学分析有很好的相关性。 （提示：PAX2是EＲα的下游分子）
12．(再从分子结构分析, PAX2的上游区有结合转录因子的结构,提示可间接结合ER。但目前还是推测，为了进一步证实），构建质粒，包含PAX2启动子2.0KB的片段和第一个外显子。雌激素与三苯氧胺可以刺激荧光素酶基因的表达，但是只在子宫内膜癌细胞，不在正常子宫内膜细胞。染色质免疫沉淀实验检测，雌激素与三苯氧胺处理的子宫内膜癌细胞，PAX2的上游区存在ERα非ERβ。在正常子宫内膜细胞没有发现。这个结果也被RT-PCR所证实。（提示：PAX2是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子）
13．为何PAX2在子宫内膜癌细胞活化，在正常的子宫内膜细胞没有活化？通过甲基化-PCR检测，子宫内膜癌组织中PAX2低甲基化，在正常的子宫内膜细胞PAX2高甲基化。而且，在正常的子宫内膜细胞，用甲基转移酶抑制了5-aza-dC，导致PAX2活化。（提示：PAX2表达的激活与PAX2启动子甲基化标志的丢失有关）。
14. 最后，作者探索了PAX2在癌细胞和非癌细胞的表达机制。在子宫内膜癌细胞，MeCP2, mSin3A，HDAC1 表达在PAX2的上游区，正常的子宫内膜细胞没这种现象。（提示：PAX2甲基化标志的丢失与包含MeCP2, mSin3A，HDAC1的蛋白复合物有关）。
心得：先看到一种有趣现象，没有现成的理论可以解释，抓住它，别放过，大胆假设，小心求证，证实后，再提出新的假设，再求证，科学的路就是这样螺旋上升，最终到达胜利的彼岸。本文最大特点是论证严谨，文章根据已有的线索，大胆推测，并且严格求证，正反两面求证，多种方法求证，体内体外求证，逻辑清楚，论证严谨，结果可靠。新手做实验往往缺乏这点，思考不严密，漏洞较多。本文用的方法比较多，包括WESTERN，PCR，免疫组化，免疫荧光，动物实验，基因芯片等等，可见基本功扎实是何等重要。作者有篇SCIENCE和本文相关，在国外做了相关实验，可见实验的连贯性很重要，story要完整才好看。新手做实验往往东一榔头，西一棒槌，实验的连贯性差，实验虽多却说不清问题，是做实验的大忌。本文的工作量也很大，一个人很难在短期完成，一个好的领队，一个好的团队也非常重要。
启发：本文是寻找分子机制的经典之作，为同类的研究树立了很好的典范。娴熟的实验技巧与广博的分生知识，在实验中起到了决定性的作用。
文章题目：
Hypomethylation-linked activation of PAX2 mediates tamoxifen-stimulated
endometrial carcinogenesis
通讯作者：尚永丰教授
尚教授的这篇nature,思路也是独具匠心。
背景知识：三苯氧胺可以治疗乳腺癌，但是与子宫内膜癌呈正相关，这是为什么呢？大家觉得好奇，作者也很感兴趣。
实验目的：雌激素和雌激素受体（ERs,也是转录因子）结合调节靶基因的转录，三苯氧胺可以结合雌激素受体封闭这种作用，但是在子宫内膜癌，三苯氧胺的分子机制又是什么呢？
实验思路：
提出假说：既然雌激素和三苯氧胺都可以结合雌激素受体，并且都可以促进子宫内膜癌的发生，那么子宫内膜癌发生的效应分子极可能存在于受雌激素和三苯氧胺共同调控的靶基因当中。基于这种假说，他们试验证明三苯氧胺不仅影响雌激素相关靶基因的表达，而且调控一系列独特的基因表达，进而发现PAX2基因在介导雌激素和三苯氧胺刺激的子宫内膜细胞的增殖和癌变过程中起着关键作用。此外，他们还发现PAX2只在子宫内膜癌细胞中被雌激素和三苯氧胺激活表达，而在正常的子宫内膜上皮细胞中则不能被雌激素和三苯氧胺激活，这种差异是由于与癌症相关的PAX2基因启动子低甲基化造成的。
实验设计（括号内为实验的意义和感想）：
1． 确定基因芯片处理时间
子宫内膜癌上皮细胞Ⅰ期，Ⅱ期分别原代培养 预实验3小时产生最大量的雌激素受体的靶基因 确定处理时间（作者对实验细节是精益求精）
2． 分3组， 雌激素处理组， 三苯氧胺处理组，无因素干扰组（对照组）。每组都重复2次，每次做2次基因芯片（可见作者对科学的严谨）
结果：共同调节的35个基因（21个上调，14个下调）
3． 年龄相当的正常的子宫内膜上皮细胞同时重复上面的实验（这个平行对照很重要）
4． 结果
4.1 基因上调：
雌激素处理组：子宫内膜癌上皮细胞（42）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(33) 。
三苯氧胺处理组：子宫内膜癌上皮细胞（51）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(35)。
4.2 基因下调：
雌激素处理组：子宫内膜癌上皮细胞（55）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(62) 。
三苯氧胺处理组：子宫内膜癌上皮细胞（63）VS. 正常的子宫内膜上皮细胞(70)。
5． 6个与细胞生长与增殖相关的代表性靶基因通过RT-PCR进行证实
其中，EKLF, PKCa，PAX2是雌激素与三苯氧胺共同上调的靶基因，上调水平分别为高，中，低。
hKID, cyclin F ， RARb1是雌激素与三苯氧胺共同下调的靶基因，下调水平分别为高，中，低。
（作者在挑选基因时，是费了心思的，既有代表性，又避免过大的劳动量）
（作者从严格的基因芯片筛选和RT-PCR两种方法相互验证，结果非常可靠，佩服作者治学的严谨）
6． 这6个基因同时在正常的子宫内膜上皮细胞，通过基因芯片筛选和RT-PCR，除了PAX2，结果同样得到证实。同样的结果在无胸腺的雌性CD鼠的子宫组织也得到证实。雌激素与三苯氧胺对子宫内膜的增殖作用，通过称量处理鼠的湿重和腔上皮的厚度，以及细胞增殖的Marker,增殖细胞核抗原，上皮细胞的Marker，Ki-67的免疫组化来证实。
（靶基因的结果在细胞和组织都得到证实，结果非常可靠）
7. 子宫内膜癌细胞系ECC-1 ,Ishikawa转染携带21个上调基因的互补DNA的逆转录病毒,流式细胞仪分析细胞的增殖情况。结果显示细胞增殖（进一步确定靶分子的效应）。转入PAX2基因的细胞增殖明显，转入EKLF, PKCa基因的细胞也增殖。21个上调基因除去这3个基因的剩余基因转入细胞，细胞增殖不明显。蛋白的表达水平通过WESTERN或RT-PCR证实。（这个实验从正面说明PAX2可能是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）。
8． 用SiRNA沉默掉这21个上调基因，流式细胞仪分析细胞的增殖情况。用SiRNA沉默掉EKLF, PKCa基因，对细胞增殖的影响不大。用SiRNA沉默掉PAX2基因，细胞增殖明显减弱。21个上调基因除去这3个基因的剩余基因，用SiRNA沉默掉，对细胞增殖的影响最小。PAX2基因的突变体（活化区阻遏区被敲除），对PAX2介导的细胞增殖起负作用。这个负作用可以被野生型PAX2所抵消。基因表达的敲除，通过WESTERN或RT-PCR证实。（这个这个实验从反面说明PAX2可能是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）。
9． 同样对14个下调基因进行以上实验，正义和反义的转染，结果发现14个下调基因和细胞的增殖关系不大。（提示：对细胞增殖起关键作用的分子，不在这14个下调基因里）
10. 建立3种老鼠体内模型，PAX2无变化的（转入空载体），PAX2过表达的（转入PAX2正义载体），PAX2敲除的（转入PAX2反义载体）。每种老鼠体内模型又分若干组，每组分别用雌激素，三苯氧胺，无因素干扰等处理，结果与体外实验符合。转入EKLF基因，老鼠肿瘤生长与上面实验的对照组相似。（从体内实验证实， PAX2是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子中，对细胞增殖起关键作用的分子）
11．二元免疫荧光染色说明PAX2和ERa的着色部位近似。RT-PCR检测PAX2的表达水平和ERa的表达水平，统计学分析有很好的相关性。 （提示：PAX2是EＲα的下游分子）
12．(再从分子结构分析, PAX2的上游区有结合转录因子的结构,提示可间接结合ER。但目前还是推测，为了进一步证实），构建质粒，包含PAX2启动子2.0KB的片段和第一个外显子。雌激素与三苯氧胺可以刺激荧光素酶基因的表达，但是只在子宫内膜癌细胞，不在正常子宫内膜细胞。染色质免疫沉淀实验检测，雌激素与三苯氧胺处理的子宫内膜癌细胞，PAX2的上游区存在ERα非ERβ。在正常子宫内膜细胞没有发现。这个结果也被RT-PCR所证实。（提示：PAX2是雌激素和三苯氧胺共同调节的靶分子）
13．为何PAX2在子宫内膜癌细胞活化，在正常的子宫内膜细胞没有活化？通过甲基化-PCR检测，子宫内膜癌组织中PAX2低甲基化，在正常的子宫内膜细胞PAX2高甲基化。而且，在正常的子宫内膜细胞，用甲基转移酶抑制了5-aza-dC，导致PAX2活化。（提示：PAX2表达的激活与PAX2启动子甲基化标志的丢失有关）。
14. 最后，作者探索了PAX2在癌细胞和非癌细胞的表达机制。在子宫内膜癌细胞，MeCP2, mSin3A，HDAC1 表达在PAX2的上游区，正常的子宫内膜细胞没这种现象。（提示：PAX2甲基化标志的丢失与包含MeCP2, mSin3A，HDAC1的蛋白复合物有关）。
心得：先看到一种有趣现象，没有现成的理论可以解释，抓住它，别放过，大胆假设，小心求证，证实后，再提出新的假设，再求证，科学的路就是这样螺旋上升，最终到达胜利的彼岸。本文最大特点是论证严谨，文章根据已有的线索，大胆推测，并且严格求证，正反两面求证，多种方法求证，体内体外求证，逻辑清楚，论证严谨，结果可靠。新手做实验往往缺乏这点，思考不严密，漏洞较多。本文用的方法比较多，包括WESTERN，PCR，免疫组化，免疫荧光，动物实验，基因芯片等等，可见基本功扎实是何等重要。作者有篇SCIENCE和本文相关，在国外做了相关实验，可见实验的连贯性很重要，story要完整才好看。新手做实验往往东一榔头，西一棒槌，实验的连贯性差，实验虽多却说不清问题，是做实验的大忌。本文的工作量也很大，一个人很难在短期完成，一个好的领队，一个好的团队也非常重要。
启发：本文是寻找分子机制的经典之作，为同类的研究树立了很好的典范。娴熟的实验技巧与广博的分生知识，在实验中起到了决定性的作用。
