Th1/Th2检测方法

Th1/Th2检测方法
Th1/Th2基础知识：
细胞因子在免疫调节过程中发挥着重要作用，其由血液中各种活化的细胞分泌，包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等。细胞因子的分泌在病理条件下会发生改变，如各种感染性疾病等。
目前，研究较多的分泌细胞因子的细胞为Th1和Th2细胞。我们知道，CD4+ T细胞被称为Th(辅助性/诱导性T细胞)，Th根据其所分泌的细胞因子的不同，又可细分为Th1细胞和Th2细胞。
Th1细胞分泌：IL-2, IFN-g, TNF-a
Th2细胞分泌：IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13
Th1/Th2检测原理：
1.活化
未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前，需刺激活化。
活化所用的刺激素为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin
2.抑制分泌
淋巴细胞在刺激素的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细胞外则检测不到，因此，必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为 Brefedlin A或Monensin
3.确定CD4+ T细胞群
Th1/Th2细胞先决条件是CD4+ T细胞，因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。
我们知道，CD4不但在T细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。因为在佛波酯的刺激作用下，CD4抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于用CD3和CD4双参数设门。用CD3和CD8设门。因CD8不受佛波脂的影响。且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞，因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。
Th1/Th2检测方法：
试剂
PMA
贮存液：PMA溶于DMSO，浓度为0.1mg/ml，-20oC保存
工作液：贮存液 1:100稀释于RPMI 1640或PBS(无菌，无NaN3)中，此时为 1mg/ml
工作浓度：25ng/ml (取25ml/ml)
Ionomycin
贮存液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20oC保存
工作液：贮存液 1:20稀释于RPMI 1640或PBS(无菌，无NaN3)中，此时为 50 mg/ml
工作浓度：1mg/ml (取20ml/ml)
Monensin
贮存液：Monensin溶于甲醇，浓度为50mg/ml,为加速溶解，可置于40oC到43oC水浴。4oC保存至少4个月
工作液：贮存液 1:50稀释于RPMI 1640或PBS(无菌，无NaN3)中，此时为 1mg/ml
工作浓度：1.7mg/ml (取17ml/ml)
RPMI1640
RPMI1640,含10%FCS(胎牛血清)，2mM glutamin,50mg/ml penicillin, 50mg/ml steptomycin和100mg/ml neomycin
抗体
细胞表面标记抗体：CD3-PC5(PerCP)，CD8-FITC
细胞内因子抗体：IL-4-PE, IFN-g-PE
破膜剂
实验步骤
1．肝素抗凝采血(必须用肝素抗凝)
2. 取两只试管分别作为阴性对照管(A管)和测定管(B管)，于两只试管中均加入100ml血液和100ml RPMI1640
3. A管中加入：3.4ml 1mg/ml Monensin工作液；B管中加入：5ml 1mg/mlPMA工作液 + 4ml 50mg/ml Ionomycin工作液 + 3.4ml 1mg/ml Monensin工作液。
4.37oC，5% CO2培养箱培养4-6小时
5.混匀，取出100ml，加入适量CD3-PC5(PerCP)，CD8-FITC，孵育一段时间(参见抗体说明书)
6.用破膜剂固定和破膜
7.加入适量IL-4-PE, IFN-g-PE,孵育一段时间(参见抗体说明书)
8.PBS洗涤一次，去上清，适量PBS重悬细胞沉淀，上机检测
结果分析
1. 用CD3设门选定淋巴细胞，如图1
2. 用CD8分别IL-4和IFN-g建立双参数直方图对第1步所确定的淋巴细胞进行分析，如图2
3. 得出CD8-/IL-4+(Th2)和CD8-/IFN-g+(Th1)细胞的百分含量