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        Th1细胞和Th2细胞的检测

        相关实验:Th1 细胞和 Th2 细胞的检测

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、检测试剂

        1. PMA 贮存液:PMA 溶于 DMSO,浓度为 0.1 mg/mI,-20℃ 保存,工作液贮存液 1:100 稀释于 RPMI-1640 或 PBS(无菌,无叠氮钠)中,此时为 1 ug/ml,工作浓度为 25 ng/ml,取 25 ug/ml 原液稀释即可。

        2. 依诺霉素贮存液:依诺霉素溶于 DMSO,浓度为 1 mg/mI,-20℃ 保存;工作液:贮存液 1:20 稀释于 RPMI-1640 或 PBS(无菌,无叠氮钠)中,此时为 50 ug/ml,工作浓度为 1 ug/ml,取 20 ug/ml 原液稀释即可。

        3. 莫能星 (monensin): 贮存液:莫能星溶于甲醇,浓度为 50 mg/mI,为加速溶解,可置于 40~43℃ 水浴。4℃ 只少保存 4 个月;工作液:贮存液 1:50 稀释于 RPMI-1640 或 PBS(无菌,无叠氮钠)中,此时为 1 mg/ml;工作浓度为 1.7 ug/ml(取 17 ul/ml)。

        4. RPMI-1640,RPMI-1640 含 10% FCS(胎牛血清),2 mmol/L 谷氨酰胺 50 ug/ml 青霉素,50 ug/链霉素和 100 ug/ml 新霉素。

        抗体:细胞表面标志抗体;CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC。

        细胞内因子:IL-4-PE,IFN-Y 等。

        破膜剂:可用美国 Caltag 公司的 Fix & Perm 破膜剂;美国 BD 公司的 FACS 破膜剂;法国 Immunotech 公司的 IntraPrep 破膜剂。

        二、检测步骤

        1. 肝素抗凝采血。

        2. 取 2 只试管,分别作为阴性对照管 (A 管) 和测定管 (B 管),于 2 只试管中均加入 100 uI 血液和 100 uI PRM1-1640。

        3. A 管中加入 3.4 ul 1 mg/ml 的莫能星工作液,B 管中加入:5 uI 1 ug/ml 的 PMA 工作液+4 uI 50 ug/ml Ionomycin 工作液+3.4 ul 1 mg/ml 莫能星工作液。

        4. 37℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 h。

        5. 混匀,取出 100 uI,加入适量 CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC,孵育一段时间(参阅抗体说明书)。

        6. 用破膜剂固定和破膜。

        7. 加入适量 IL-4-PE,IFN-y PE,孵育一段时间 (参阅抗体说明书)。

        8. PBS 洗一次,去上清;适量 PBS 重悬细胞沉淀,上机检测。

        三、结果分析

        1. 用 CD3 设 门,选定 T 淋巴细胞。

        2. 用 CD8 分别和 IFN-γ建立双参数直方图对第一步所确定的淋巴细胞进行分析。

        3. 得出 CD8/IFN-γ+(Th1)和 CD8-/IL-4+(Th2)细胞百分含量。

        来源:丁香实验

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