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        (交流)ELISPOT的一点介绍

        丁香园论坛

        2509
        1 起源与发展:
        1983年, Czerki8Dnsky;Sedgwick and Holt:
        计数 B cells
        1988年,Czerkinsky: T cell IFN-r
        1988年,Czerkinsky:双色标记(Dual-Color)
        1993年,第一台ELISPOT自动分析仪:德国Leica
        96-97年,出现了新的ELISPOT分析仪

        2 ELISPOT 和 ELISA的区别:
        ELISA 回答 “how much”,而ELISPOT回答“What freqency”
        ELISA是ImmunoAssay,而ELISPOT是“Bio-Assay”
        ELISA非特异,ELISPOT特异性T细胞群

        3 其优点:
        检测可分泌性细胞因子(蛋白),少至100-1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。Tanguay, S. and Killion, J. J. (1994) Direct comparison of ELISPOTand ELISA. Based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13. 259-263
        单细胞水平,少至一个阳性效应细胞即能够被检测出。比FACS灵敏100-1000倍。
        大样本量检测:每个研究人员每天可作数百样本的检测。

        4 一般操作流程:
        包被抗体 4℃ 过夜 (室温或者 37 ℃数小时)

        封闭37 ℃一小时

        加入淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育20~40小时

        加入检测抗体37 ℃一小时

        加入酶联二抗37 ℃一小时

        显色10~60分钟

        5技术要点:
        外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低
        只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、其他细胞(特别是粒细胞)、和杂质的干扰
        加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
        预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡(培养液变黄)会影响斑点的形成
        预孵育后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液
        在ELISPOT板上同时进行抗原刺激、细胞孵育、和抗体结合可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用两步法,分别进行抗原刺激、ELISPOT板抗体捕获
        部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡,可以换用单价抗原刺激物
        核酸、甾体类、等抗原刺激物的免疫原性较弱,应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等
        一般要点:无菌操作,避免污染;细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动,包括开关CO2孵箱;显色至可见斑点、时间可适当延长、背景的褪色
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