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        【原创】HLA高低分辨分型试剂(HLA-A、B、C、DR、DQ、DP)

        丁香园论坛

        8082
        上海迈程医疗器械有限公司
        专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型(A,B,C,DR,DQ),B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
        愿意真诚为您服务!
        请致电:18930640599 mail:jason725@139.com

        由美国德州生物基因有限公司(Texas BioGene,Inc)生产出新型新型HLA- ABDR SSP Morgan?试剂盒,该试剂根据亚洲人种特点而独特设计,可用于HLA I类A,B位点和Ⅱ类DR位点等位基因低分辨分型检测。试剂独特的96套引物设计,不仅可以扩增涵盖所有Tissue Antigen(International Nomenclature Committee of WHO)中所包括所有等位基因,同时还可以扩增自1996年到2009年Tissue Antigen 杂志中发布的所有新等位基因。SSP Morgan TM 试剂具有可靠、简便以及重复性高等显著特点。

        1)Morgan TM System HLA-ABDR 操作手册

        一,试剂盒组成:
        1.试剂分为1×96、2×96、4×96四个类型,每个test 含有96个引物。
        2.8M buffer----612μl/管。
        注意:使用前请在-20度保存
        3.热循环反应封板纸。
        4.引物特异性列表、判读表。
        5.新版本判读软件光盘,光盘含有在Morgan TM系统中所包括的所有试剂的分析软件
        没有提供的原材料、试剂及仪器
        1.Taq 酶。
        2.双蒸水。
        3.96孔V型板用热循环仪-——本试剂盒是按照Perkins Elmer 9700 PCR仪标准设计的。
        4.0.5×TBE电泳缓冲溶液。
        5.电泳系统(德克萨斯生物公司提供凝胶系统)。
        6.DNA 分子量标。
        7.电泳电源。
        二,DNA样品准备
        一切可以分离得到高质量DNA样品的方法均可以应用。(强烈推荐使用本公司生产的BioGene-FastTM以及ExpuzeTM DNA 提取试剂盒)
        1.血样应该收集到用EDTA或者ACD处理过的抗凝管中。
        2.提取DNA样品存度要求:
        A260/A280比值应大于1.65
        凝胶电泳在分子量略大于10kb左右在出现清晰的一条带。
        3.DNA样品浓度要求在10-80ng/μl(Morgan TM系统可以允许DNA浓度在较大的范围内变化)。
        三,PCR 准备
        1.将配型试剂,8M buffer,DNA样品,Taq酶等相关试剂放在架子上。
        2.严格按照以下步骤配置PCR反应液
        容量(ul/孔)总数(ul)
        DNA(10-30ng/ul)2.0204
        8M buffer6.0612
        Taq酶(5u/ul)0.044.5
        总数8.0820.5
        在8M buffer 小管中加入浓度位5U/μl Taq酶4.5μl,混匀,在每个test的第一孔加入8μl作为质控。 加入204μl DNA样品到上面试管中(8M buffer /Taq 酶),充分混匀。
        3.在剩下的各孔中加入8μl上述混合液
        4.用耐热封口纸封好试剂板。
        5.压上热垫,进行PCR扩增
        四,扩增程序
        本公司DNA配型试剂是按照Perkin ElmerAmp 9600和9700标准设计的 。每次扩增时间大约1小时25分钟。
        SegmentCycle numberTemperatureTime
        1112℃5 min
        2196℃2.5 min
        31095℃20 sec
        65℃60 sec
        42295℃15 sec
        62℃50 sec
        72℃30 sec
        514 ℃Until removed

        五,胶电泳
        1.用DNA级的琼脂糖和0.5× TBE缓冲液配置浓度为2.5%的琼脂糖凝胶。当应用德克萨斯凝胶系统时,每块96孔胶需要70 ml 2.5%琼脂糖溶液。
        2.按照次序依次每孔加入6μl PCR 扩增产物(#1 空用黑色的小点标记)。
        3. 凝胶在每厘米10伏特电压下电泳,知道红色的色带离加样孔0.7-1.0厘米,电泳结束。
        4. 将凝胶取出放在紫外成像系统中。
        六,阅读凝胶
        1.每条电泳道(除了第一条电泳道)都会显示大小位600 bp 的内部质控带
        2.应用计算机软件或者判读表对阳性条带进行配型,以得到DNA样品的HLA型号。
        3.污染监测孔(第1孔)中出现阳性特异带,结果无效。
        4.如果内部指控以及特意性条带均没有出现表明反应失败。
        5.非特异性条带,出现的条带大小和标准不一致,出现的原因是由于不明原因的非特异性扩增。去掉这些条带,再进行判读。
        常出现问题以及解决方法
        1.没有扩增出条带或条带不清晰。可能的原因以及相关的解决方法:
        a.肝素影响:用Expuze TM 试剂盒分离提取DNA
        b.DNA质量不高:用Expuze TM 试剂盒纯化DNA,或者用该试剂盒重新提取DNA样品
        c.DNA样品量不够:增加DNA量
        d.抑制物的存在:将DNA样品加热到95℃ 5分钟,然后进行PCR反应或者是再次分离DNA
        e.Tap酶活力不对:联系Taq酶供应商,或者咨询德克萨斯生物科技有限公司以便获得好品牌的Taq酶。
        2.非特异性阳性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法:
        a.过量的DNA或者过量的Taq酶:重新测定DNA浓度并调整DNA的加样量;小心精确的量取DNA酶。
        b.不准确的热循环温度:校对热循环温度。
        c.DNA被别的DNA污染:从原来的血浆中重新分离DNA样品。
        3.非特异性阴性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法:
        a.不准确的热循环温度:校对热循环温度。
        b.DNA、ddH2O以及Taq酶混合不均匀:在加入反应孔前充分的混合。

        上海迈程医疗器械有限公司 专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型(A,B,C,DR,DQ),B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
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