【共享】碱法质粒抽提
丁香园论坛
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碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。
具体分析及原理:
1，25 mM Tris-Cl。控制溶液的pH。
2，50 mM葡萄糖。悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
3，10 mM EDTA，pH 8.0。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
4，新鲜的0.4 N的NaOH。NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，
第一， 时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合
溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
5，2 M 醋酸。中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
6，酚/氯仿/异戊醇。进行抽提，后行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
7，乙醇。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
这是我看过一片文章后,稍稍提炼出来的.
原文见: 生物谷网站 http://www.bioon.com.
我做质粒小提遇到一些问题,卡了将近一星期.此文对我帮助很大,感谢作者.希望此文对需要做质粒小提的朋友有所帮助.
再次感谢作者.
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。
具体分析及原理:
1，25 mM Tris-Cl。控制溶液的pH。
2，50 mM葡萄糖。悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
3，10 mM EDTA，pH 8.0。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
4，新鲜的0.4 N的NaOH。NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，
第一， 时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合
溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
5，2 M 醋酸。中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
6，酚/氯仿/异戊醇。进行抽提，后行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
7，乙醇。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
这是我看过一片文章后,稍稍提炼出来的.
原文见: 生物谷网站 http://www.bioon.com.
我做质粒小提遇到一些问题,卡了将近一星期.此文对我帮助很大,感谢作者.希望此文对需要做质粒小提的朋友有所帮助.
再次感谢作者.
