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        克隆法

        最新修订时间:

        原理

        限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段,经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切:
          50 μl反应体系,用1.5ml tube,冰上操作)
          DNA           30 ul
          R.E           1 ul
          10xbuffer        5 ul

          ddH2O           14 ul


          外源片段酶切产物和5 ul 37 ℃反应1hr,分别取8 ul PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全;按2-5步纯化、回收DNA

          2.  加入ddH2O 150  (扩大体积),加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀,12000 g离心10 min;

          3.  吸取上清,加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇,-20 ℃放置15分钟以上;

          4.  12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟;

          5.  ddH2O(1.5 ml ddH2O(0.5 ml tube中),PUC18溶于20 ul 倒去上清,用75%乙醇浸洗沉淀,风干后外源DNA溶于10  tube中);

          6.  按以下反应去除载体PUC18的5'磷酸基团,50 ℃反应30 min 以上
          DNA                   20 ul

          CIAP(TaKaRa)        0.5 ul

          buffer              4.0 ´10 μl

          ddH2O               15.5 ul


          7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活;

          8.  按2-5步纯化载体,溶于10 ul ddH2O;

          9.  连接反应
          DNA                10 ul
          pUC18            2.5 ul
          buffer           1.5 ´ 5 ul
          mT4 ligase   3 U/ul

          16 ℃水浴过夜

          10.  转化大肠杆菌感受态细胞

          11.  转化子的鉴定


        注意事项

        1. DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。


        2. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用,它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏,操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂,能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服,并在通风橱中进行。

        常见问题

        1. 克隆中所用到的几种酶:(1)限制性内切酶(2)碱性磷酸酶(3)连接酶(体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶:大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶),但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶,因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。


        2. 载体的负载能力:即能克隆多大的DNA片段,是否有合适的限制性内切酶位点,酶切位点的性质,粘性或平末端,是否有选择重组克隆的其它标记,如蓝白斑筛选等。

        来源:丁香实验

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