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        🔥 TOPflash 实验检测 wnt 通路的激活情况

        相关实验:Wnt/β-catenin 信号通路

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 李锦斐博士

        肿瘤学 北京协和医学院

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 聂壹峰博士

        纳米生物医学 中国科学院大学

        简介

        TOPFlash(报告基因质粒) 是用于检测 Wnt 信号通路中β-catenin 介导的 TCF/LEF 转录活性水平的报告基因质粒。

        TOPFlash 是以 pGL6-TA 为模板,在其多克隆位点插入两组 TCF/LEF 结合位点序列,每组有三个重复序列,一组为正向序列,另一组是它的反向互补序列,可以高灵敏度地检测 TCF/LEF 的转录活性水平。

        LEF 和 TCF 与 Groucho 结合能够抑制 Wnt 调控的下游基因表达,同时细胞核内β-catenin 和 TCF/LEF 形成转录复合物能够激活 Wnt 信号通路下游的基因表达,因此可以用来检测 Wnt 通路的激活情况。

        原理

        作为重要的信号通路之一 Wnt 信号通路与干细胞多能性、胚胎发育、肿瘤的发生等都有着密切的关系,其关键步骤是关键因子β-catenin 的稳定性及是否进入细胞核内,从而决定 Wnt 信号下游基因的表达。

        当细胞外缺少 Wnt 蛋白时,细胞浆内的β-catenin 被招募到由 APC 及 Axin 等组成的降解复合物上,β-catenin 被 CK1α和 GSK3β 磷酸化,从而导致其与 E3 泛素连接酶 β-TrCP 的结合并进入泛素化和蛋白酶体依赖的降解途径。

        因此在非激活状态下,细胞浆内的 β-catenin 蛋白水平保持着较低的水平,而细胞核内 LEF 和 TCF 与 Groucho 结合抑制了 Wnt 调控的下游基因表达。
        当 Wnt 蛋白结合到受体复合物时,相应的信号通路就被激活。

        在细胞核内 β-catenin 和 TCF/LEF 形成转录复合物,从而激活了 Wnt 信号通路下游的基因如 c-Myc 和 cyclin D1 等的表达,由于 TCF/LEF 转录活性水平与萤光素酶的表达量成正比,因此可以测定细胞内 Wnt 信号通路的激活水平。

        用途

        TOPFlash 被广泛应用于 Wnt 信号通路的研究,通常用 FOPFlash(D2503) 带有突变的 TCF/LEF 结合位点序列作为其阴性对照。

        材料与仪器

        材料:

        1. NIH3T3 或 HEK293 细胞系

        2. 纯化的活性 Wnt3a 蛋白

        3. 胎牛血清(FBS)

        4. DMEM(高葡萄糖)

        5. TransIT-2020

        6. TCL/LEF-萤火虫荧光素酶表达构建体

        7. pRL-SV40-海肾萤光素酶表达构建体

        8. Dual-Luciferase @ Reporter Assay System

        9. 生长培养基

        10. Wnt3a 条件培养基:通过收集稳定表达 L-Wnt3a 蛋白的小鼠成纤维细胞的上清液,然后以 1:10 的比例在 DMEM + 2% FBS + 1% PS 中稀释来制备 Wnt3a 条件培养基。

        11. 血清剥夺的媒体:DMEM 及 2% FBS,含有各种浓度的 Wnt3a 条件培养基

        设备:

        1. T75 培养瓶

        2. 24 孔组织培养板

        3. 96 孔板

        4. 离心机

        5. 水浴加热锅

        6. CO2 培养箱 

        7. Berthold 光度计

        步骤

        一、从液氮培养基中培养低传代 NIH3T3 或 HEK293 细胞

        1、在 37 ℃ 水浴中短暂解冻细胞

        2、将细胞移液管放入 15 ml 离心管中,在 1 500 转离心 5 分钟。吹打抽吸培养基,将细胞重新悬浮在 15 ml 生长培养基中,并在 T75 培养瓶中培养 (细胞在 37 °C 和 5% CO2 中以 1×106 的密度培养)。

        3、当细胞生长到 60% 未融合时,分裂细胞。

        4、在进行实际检测前,应将细胞株传代 1~2 次,然后按照实验条件将细胞装入 24 孔板中,每孔重复 3 次(5×104 个细胞/孔)。

        二、转染

        1、第 0 天:在 500 μl 完整培养基(DMEM/10% FBS)中种植细胞(密度如上所述)。

        2、第 1 天:转染(使用比例为 7XTCL/LEF-firefly 荧光素酶:pRL-SV40- Renilla 荧光素酶为 10:1;使用 1.5 μl TransIT-2020/300 ng DNA/孔)

        3、第 2 天:转染后 24 小时更换培养基(最佳)

        4、第 3 天:换成去血清培养基。

        5、第 5 天:裂解细胞(1×全细胞裂解缓冲液,由 Dual-Luciferase @ Reporter Assay System 提供)并从细胞裂解中收集不同的上清液(20 μl),将它们平板接种到 96 孔板中。

        三、读取发光信号

        1、解冻双荧光素酶报告试剂。

        2、用 firefly 荧光素酶和 Renilla 荧光素酶底物试剂启动光度计。其中 firefly 荧光素酶底物是 D-荧光素的衍生物,萤火虫萤光素酶化学反应将产生氧化萤光素和 560 nm 的特定光信号,可由光度计检测到。Renilla 荧光素酶底物是 Coelenterazine 的衍生物,Renilla 荧光素酶反应可产生 Coelenterazine 并且光度计可以检测到在 480 nm 处的特殊光信号。依次加入 20 μl 每种底物,并立即通过光度计测量产生的光信号(光信号在环境温度下在光度计的封闭腔室中检测)。

        3、检测 firefly 和 Renilla 荧光素酶信号(firefly 荧光素酶信号 560 nm 检测,Renilla 荧光素酶信号在 480 nm 检测)。

        4、用矫正后的读数作图,分析数据。

        注意事项

        1、荧光素见光易被氧化,已稀释未用的荧光素应丢弃。

        2、如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测,样品可以在冰上保存大约 5 h,在 -80 ℃ 可保存数月,不要反复冻融以避免酶活性的降低。

        3、一些荧光仪在进行检测前需要 1~2 s 的稳定,因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。

        来源:丁香实验

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