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        【讨论】为什么筛个稳转株这么难

        丁香园论坛

        3887
        现在用pEGFP-IRES2载体转染黑素瘤B16F10细胞 筛选前转染效率有20% 先1:10传代 再用700-1100mg/L G418分组筛选 基本3天后就没什么绿的了 我晕 两个月啦 就这么耗时间 后面实验。。。

        大家有什么建议啊
        你可以考虑换个高转染效率的方法,比如用病毒构建稳定细胞
        G418浓度太高了,一般筛选浓度为400ug/ml
        在做稳定细胞株之前首先要摸清楚G418的使用浓度,不同细胞对G418耐受性是不一样的,一般选择10-14天左右杀死全部细胞的G418作为后期筛选浓度。

        另外,楼主细胞转染效率太底了,才20%,即使转进去了也不一定整合到基因组里面。
        zwh2004 wrote:
        在做稳定细胞株之前首先要摸清楚G418的使用浓度,不同细胞对G418耐受性是不一样的,一般选择10-14天左右杀死全部细胞的G418作为后期筛选浓度。

        另外,楼主细胞转染效率太底了,才20%,即使转进去了也不一定整合到基因组里面。
        B16F10是有名的难转细胞株 能转到这么高 应该不错了吧~~~
        我刚转的,用PEI,效率可以达到40-50%,很好建立稳定细胞系
        我做过pEGFP-IRES2的稳转 MCF-7和231细胞

        还是能做出稳转单克隆的 但效率比较差

        因为很多细胞对G418都有抗性

        所以G418筛出的 最后绝大多数是假阳性

        但有荧光嘛 还好说

        ls说能有40-50%的效率 不知道用的是什么细胞



        ps:G418筛选稳转 基本可以淘汰了

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

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