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        CST抗体 Western Blot 问题解答

        互联网

        3438
         

        1.Problem:高背景(曝光 1-30 秒后,背景高或无特异性蛋白带)

        2.Problem:信号弱(1-30 秒的曝光后检测不到信号)

        3.Problem:无着色

        4.Problem:着色太浅

        5.Problem:着色太深

        6.Problem:不正确的染色

        Problem:高背景(曝光 1-30 秒后,背景高或无特异性蛋白带)

        Problem:高背景(曝光1-30秒后,背景高或无特异性蛋白带)

        Cause:一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度

        Solution:使用推荐的阻断剂和 TBS/T 稀释抗体并 4℃ 孵育过夜。多克隆抗体使用 5% 的 BSA;单克隆抗体使用 5% 的脱脂奶粉

        Cause:化学发光检测时没有使用相应的膜

        Solution:使用高质量的 nitrocellulose 或 PVDF 膜

        Cause:膜阻断不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合

        Solution:用含 5% 脱脂奶粉的 TBS/T 在室温阻断 1 小时(不能超过一个小时)

        Cause:二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度,或二抗的特异性差

        Solution:一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验,在没有一抗的情况下,直接加入二抗孵育。也可将二抗用含 5% 脱脂奶粉的 TBS/T 在室温下孵育 1 小时

        Cause:配制试剂的用水水质不佳

        Solution:在配制试剂时(尤其是磷酸化抗体)使用 Milli-Q 或其它超纯的去离子水


        Problem:信号弱(1-30秒的曝光后检测不到信号)
        Cause:一抗孵育不足 Solution:适当延长孵育时间(4℃ 孵育过夜)
        Cause:转膜不完全 Solution:转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白 Marker 监控转膜的过程
        Cause:阻断膜超时 Solution:阻断膜的时间不能超过 1 小时
        Cause:蛋白的表达水平低于检测底限 Solution:在每孔中加入更多的蛋白;先采用免疫沉淀法富集蛋白;换用表达高的样本或细胞;检测前适当刺激蛋白的表达
        Cause:二抗与一抗的结合率太低 Solution:提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗
        Cause:配制试剂时发生交叉污染 Solution:重新配制各种试剂

        CST 免疫组化 疑难解答

        Problem:无着色
        Cause:组织切片的质量不好或固定不足 Solution:更换好的组织切片
        Cause:底物反应时间太短 Solution:延长底物反应时间,直至出现着色
        Cause:不合适的一抗或二抗 Solution:更换一抗或二抗
        Cause:没有执行抗原修复 Solution:执行抗原修复
        Cause:试剂的配制不正确 Solution:重新配制试剂
        Cause:蛋白表达太低 Solution:加入对照试验

        Problem:着色太浅
        应时间太短 Solution:延Cause:底物反长底物反应时间
        Cause:一抗的浓度太低或孵育不足 Solution:提高一抗的浓度(1:50;1:100)
        Cause:蛋白表达太低 Solution:加入对照试验
         
        Problem:着色太深
        Cause:底物反应时间太长 Solution:减少底物反应时间
        Cause:一抗或二抗的浓度太高 Solution:降低一抗或二抗的浓度 2-3 倍
        Cause:切片的质量不好 Solution:选用质量好的组织切片
        Cause:组织切片没有进行阻断 Solution:用含 5% 血清的阻断液阻断 1 小时
        Cause:冲洗不完全 Solution:每次冲洗时间不低于 5 分钟
        Cause:二抗与样本发生交叉反应 Solution:选用合适的二抗

        Problem:不正确的染色
        Cause:底物反应时间太长 Solution:减少底物反应时间
        Cause:一抗或二抗的浓度太高 Solution:降低一抗或二抗的浓度 2-3 倍
        Cause:阻断不足 Solution:延长阻断时间或提高血清浓度
        Cause:切片的质量不好 Solution:选用质量好的组织切片

        生物秀 Western Blotting 专题:

        http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm

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