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        如何收集用于western blot的细胞

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        问:我现在在养细胞,然后收细胞抽蛋白以及提 RNA 用,我想先多收点细胞冻着。想问一下怎样收集细胞,有具体的流程吗?
         
        我是这样做的:
         
        1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心
         
        2、倒去上清,加 1 mlPBS 打匀后转移至 1.5 ml EP 管
         
        3、离心 12000 rpm 2 min (不知道大家这里用多少转速,有讲究吗?)
         
        4、倒去上清,我是将 EP 管倒置一会,但是 EP 管里面还是有一些上清,我没有倒干净,请问是不是要倒干净上清啊? 因为我暂时还不抽提,离心后 EP 管是放到-80 度冰箱保存的。这个上清对抽蛋白和 RNA 有影响吗?
         
        问题答复:
         
        收集流程没有什么特殊的,和你写的一样,主要注意以下事项:
         
        1、1 ml 的 PBS 可能溶不了那么多细胞 (如果你细胞多的话),所以建议用 3 mlPBS,分两管装,离完心后用 Trizol 溶解合成一管
         
        2、离心的速度太大了,细胞会死的,建议 800 转,5 分钟,一般的细胞都可以离下来
         
        3、需要去上清,如果是提 RNA 就用 Trizol 溶解合成一管,然后放在-80 度冰箱,如果提蛋白就直接将离心后的细胞放在-80 度冰箱。上清对于提蛋白和 RNA 没什么影响。还有一点,提 RNA 的东西一定要高压,如果是初次做可以用 DEPC 水泡枪头,可以提高作成功的几率。如果操作严格,可以只把要用的枪头和 EP 管高压即可。
         
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