中药功能基因研究方案 助力推动中医中药研究
吉凯基因
2069
季博心中有个结，当年在复旦工作的时候，帮一位临床医生看课题，结局是拿了两个国自然面上。这个结局很好吗？如果好，就不是季博心中的结了。因为，由于实验技术的限制，没能有 5 分以上的文章。
在做科研中，有两个事情，一个是提出科学问题后，我知道怎么去做。另一个是，我怎么做到。「知道」和「做到」。其实国自然中「可行性分析」说是给专家看的，其实是给我们自己看的。如果一个课题仅仅知道怎么做，却不能「做到」，对于临床疾病的研究，又有什么用呢。季博不断分享高分文章，是想让大家「知道」临床科研怎么去做。而今天要说的东西，目的是让您能够「做到」。
中药国粹，期待我辈振兴！！！季博有个美好的愿望，通过不断分享高分文章，让更多的人了解中药研究，继而对中药研究感兴趣。再加上帮助大家「做到」，从而推动中医中药研究，加速中药现代化。
中药研究中，大道至简，总结一句话就是「药物 E 通过调控 A 基因影响 B 信号通路抑制 C 疾病的发生发展 」。不同的疾病，研究的方式稍有不同。今天以肿瘤为例。威胁人类健康的三大杀手，第一是心脑血管病，第二是肿瘤。为啥不以第一为例呢，因为今天说的是「做到」，从可行性角度，肿瘤的研究，从技术层面，哪怕你在偏远山区，只要有简单分子细胞实验室，就可以开展了。
C 疾病是我们研究人员自己定的，药物 E 也是我们研究人员自己定的。那么研究什么呢，最重要的就是 A 基因了。药物下游发挥功能的基因，也就是药靶。所以，我们的方案，就是寻找这个 A 基因-药物的药靶。
吉凯基因中药功能基因研究方案（肿瘤方向）
PS：虽然说是肿瘤方向，其实其他疾病是相似的。
一、确定细胞模型及药物功能
1、疾病细胞模型
其实，在常规课题设计中，季博说「科研第一步是确定细胞模型和检测指标「。为啥这里不说确定检测指标呢，因为这个不用说呀，药物治疗就是杀伤肿瘤细胞为最终目的。这里的检测指标就是抑制增殖，促进凋亡。
细胞的要求是：
a、可以进行慢病毒感染操作。目前基因在细胞内的操作，最好的工具就是慢病毒介导了。所以从一开始就高要求，细胞必须能够进行慢病毒操作。
b、细胞可以进行高通量功能筛选。为啥加这个呢，因为这个方案，是必须确保能够出阳性结果。而要必须确保出阳性结果，一个很好的方式就是高通量筛选（跟国际大药厂学的，用的筛选平台也一样）。所以，高要求，细胞必须能够进行高通量功能筛选。
做肿瘤研究的筒子这一步可不用担心没好用的工具细胞，吉凯有 300 株以上的细胞系，大部分肿瘤都有符合这两个条件的工具细胞。
2、药物功能
a、在工具细胞上检测 IC50。很多老师说，我自己做过了，不用做了。其实，相同的药物不同的细胞，IC50 是不同的。高要求，必须在后续使用的工具细胞上进行 IC50 检测。
b、根据 a 步骤得出的 IC50，在 IC50 的浓度上边和下边各取一个浓度（加上对照是 3 组），采用 CCK8 检测药物抑制细胞增殖情况，连续检测 4 天。这个步骤是从药物浓度梯度和时间梯度上证明药物可以抑制细胞增殖。
二、药物下游差异基因筛选
很多老师说，药物在细胞上有效了，找药物下游基因，加药和阴性对照做个全基因组表达谱芯片就可以了。哈哈。您说对了。不过，只对了一部分。
1、差异基因芯片筛选
加药组和阴性对照组进行全基因表达谱芯片，寻找药物处理后改变的基因。这里是做 4V4 芯片。为啥组内做 4 张呢，3 张不就有统计学意义了吗。大家注意，高要求，因为我们是做药物，组内可能会偏差大，而组内一旦偏差大，就如老外说的，「rubbish in, rubbish out」，数据基本没啥用了。为确保做了就一定能有东西，组内 4 个重复，在数据分析时，如果有偏差大的样本，去掉该样本数据，确保组内有 3 个可靠的重复数据进入下游统计分析。
2、差异基因与疾病相关性分析
这一步很多人有疑问。比如我做肺癌，A 基因在肝癌中报道过，但在肺癌中没报道过。这个基因好不好呢。其实，对于高要求的药物研究，原则就一个，在肺癌中没报道过。如果在肝癌中报道过，我重点就落药物和基因的关系（参考「西兰花真的可以防癌吗」里面的 6 分范文）。如果基因在其他肿瘤也没报道过，我重点就先落基因与肿瘤的关系（参考「西兰花真的可以防癌吗之二」里面的 6 分范文）。
从分析的基因中，选取加药后下降的 30 个基因。为啥选择下降的，因为加药后细胞死，基因下降，后面我采用 RNAi 人为让基因下降，如果细胞也死，说明我们找对基因了。不过，如果您想做加药上调基因，也可以，后面高通量功能筛选，基因操作工具也可以用 cas9-SAM 进行过表达高通量功能筛选。不过，风险大些，您的经费要多些。
三、候选基因功能筛选
1、候选基因药物相关性验证
选取的 30 个基因，采用 QPCR 技术，在加药细胞与阴性对照细胞间进行检测。确保进入后续的基因是加药后下降的基因。这里选择 20 个基因进入下游。
2、候选基因操作工具制备
这里的基因操作工具是慢病毒介导的 RNA 干扰。每个基因设计 3 条以上片段，3 个片段混合包装成慢病毒（MIX）。RNAi-MIX 进入下游。
有老师问，为什么不把这 20 个基因的有效片段检测出来后，用单独的有效片段去做呢。这个是单个基因研究和大规模筛选的区别，我们也是跟国外大药厂学习的。大规模筛选的目的是缩小范围，快速并经济的方案是最佳的。等缩小范围了，再细化各个细节。一般我们 20 个基因筛选，阳性率为 10%，会获得 2 个阳性基因。如果我一开始，就把 20 个基因的有效片段都筛选出来，大家可以算算，需要的费用和时间。跟谁比呢，跟我后面只需做这两个基因的有效片段验证，哪个方案更快，更省。（额，这算不算商业机密呀）。注意，RNA 干扰在没有获诺贝儿奖之前，商业化提供服务的时候就说过，一个基因设计 3 个靶点，至少有一个靶点是有效的。所以，MIX 用来进行高通量筛选是最好的选择。
吉凯基因现在有现成的文库，包括 RNA 干扰文库，Cas9 文库（敲除和过表达），和过表达文库。在工具上达到高通量功能筛选的要求。
3、高通量功能筛选
核心步骤。在这一步，我们获得了，MIX 干扰后细胞增殖受到抑制的基因。这个基因总结来说，a、受药物调控，加药后下降。b、采用 RNA 干扰下调后，细胞增殖受到抑制。c、该肿瘤中未报道过。这时我们可以叫他药靶了。
4、工具验证
因为就两个基因，这时就一个一个做了。看看哪个靶点是最有效的。后续的实验就用这个明确的有效靶点。
四、药靶细胞功能学完善
这个基因是有功能的，前面就只有一个细胞功能学实验。这里就采用其他细胞功能学再次确证这个基因的功能。
CCK8、BrdU、细胞凋亡、caspase3/7 活性检测、增殖或凋亡 marker WB 检测、克隆形成等。都是增殖方向的细胞功能学实验。大家注意，吉凯基因提供科研服务，目的是增加您的价值。合作方案到这里，是有承诺的。找到的这个基因，在这些实验中，至少有 3 个实验是阳性的，才算 OK。如果不 OK，返回高通量功能筛选，重新筛。因为我们有工具库，有筛选平台。一切都为提升您的价值。
您想申国自然吗，到这里，有基因了，基因与药物的关系及基因功能也确定了。课题的科学性没有问题了。如果要确保中标率，就看您写标书的文字功底了。
想发文章吗，不建议发，因为，这个基因是个很好的种子。现在去发表，SCI 没有问题，但分值不高。建议把这个种子养养大，养大后，卖个好价钱。啊，不，卖个好分值。
如何养呢。额，很多人说季博写东西罗嗦，今天写得够多了。不说了。想了解怎么把这个种子养大的老师，跟我们联系吧。
一切都为提升您的价值而努力。
中药国粹，期待我辈振兴！！！
PS：希望和季博在学习、实验上有更多交流的朋友们，可以关注吉凯基因微信并回复「季博」两字。
在做科研中，有两个事情，一个是提出科学问题后，我知道怎么去做。另一个是，我怎么做到。「知道」和「做到」。其实国自然中「可行性分析」说是给专家看的，其实是给我们自己看的。如果一个课题仅仅知道怎么做，却不能「做到」，对于临床疾病的研究，又有什么用呢。季博不断分享高分文章，是想让大家「知道」临床科研怎么去做。而今天要说的东西，目的是让您能够「做到」。
中药国粹，期待我辈振兴！！！季博有个美好的愿望，通过不断分享高分文章，让更多的人了解中药研究，继而对中药研究感兴趣。再加上帮助大家「做到」，从而推动中医中药研究，加速中药现代化。
中药研究中，大道至简，总结一句话就是「药物 E 通过调控 A 基因影响 B 信号通路抑制 C 疾病的发生发展 」。不同的疾病，研究的方式稍有不同。今天以肿瘤为例。威胁人类健康的三大杀手，第一是心脑血管病，第二是肿瘤。为啥不以第一为例呢，因为今天说的是「做到」，从可行性角度，肿瘤的研究，从技术层面，哪怕你在偏远山区，只要有简单分子细胞实验室，就可以开展了。
C 疾病是我们研究人员自己定的，药物 E 也是我们研究人员自己定的。那么研究什么呢，最重要的就是 A 基因了。药物下游发挥功能的基因，也就是药靶。所以，我们的方案，就是寻找这个 A 基因-药物的药靶。
吉凯基因中药功能基因研究方案（肿瘤方向）
PS：虽然说是肿瘤方向，其实其他疾病是相似的。
一、确定细胞模型及药物功能
1、疾病细胞模型
其实，在常规课题设计中，季博说「科研第一步是确定细胞模型和检测指标「。为啥这里不说确定检测指标呢，因为这个不用说呀，药物治疗就是杀伤肿瘤细胞为最终目的。这里的检测指标就是抑制增殖，促进凋亡。
细胞的要求是：
a、可以进行慢病毒感染操作。目前基因在细胞内的操作，最好的工具就是慢病毒介导了。所以从一开始就高要求，细胞必须能够进行慢病毒操作。
b、细胞可以进行高通量功能筛选。为啥加这个呢，因为这个方案，是必须确保能够出阳性结果。而要必须确保出阳性结果，一个很好的方式就是高通量筛选（跟国际大药厂学的，用的筛选平台也一样）。所以，高要求，细胞必须能够进行高通量功能筛选。
做肿瘤研究的筒子这一步可不用担心没好用的工具细胞，吉凯有 300 株以上的细胞系，大部分肿瘤都有符合这两个条件的工具细胞。
2、药物功能
a、在工具细胞上检测 IC50。很多老师说，我自己做过了，不用做了。其实，相同的药物不同的细胞，IC50 是不同的。高要求，必须在后续使用的工具细胞上进行 IC50 检测。
b、根据 a 步骤得出的 IC50，在 IC50 的浓度上边和下边各取一个浓度（加上对照是 3 组），采用 CCK8 检测药物抑制细胞增殖情况，连续检测 4 天。这个步骤是从药物浓度梯度和时间梯度上证明药物可以抑制细胞增殖。
二、药物下游差异基因筛选
很多老师说，药物在细胞上有效了，找药物下游基因，加药和阴性对照做个全基因组表达谱芯片就可以了。哈哈。您说对了。不过，只对了一部分。
1、差异基因芯片筛选
加药组和阴性对照组进行全基因表达谱芯片，寻找药物处理后改变的基因。这里是做 4V4 芯片。为啥组内做 4 张呢，3 张不就有统计学意义了吗。大家注意，高要求，因为我们是做药物，组内可能会偏差大，而组内一旦偏差大，就如老外说的，「rubbish in, rubbish out」，数据基本没啥用了。为确保做了就一定能有东西，组内 4 个重复，在数据分析时，如果有偏差大的样本，去掉该样本数据，确保组内有 3 个可靠的重复数据进入下游统计分析。
2、差异基因与疾病相关性分析
这一步很多人有疑问。比如我做肺癌，A 基因在肝癌中报道过，但在肺癌中没报道过。这个基因好不好呢。其实，对于高要求的药物研究，原则就一个，在肺癌中没报道过。如果在肝癌中报道过，我重点就落药物和基因的关系（参考「西兰花真的可以防癌吗」里面的 6 分范文）。如果基因在其他肿瘤也没报道过，我重点就先落基因与肿瘤的关系（参考「西兰花真的可以防癌吗之二」里面的 6 分范文）。
从分析的基因中，选取加药后下降的 30 个基因。为啥选择下降的，因为加药后细胞死，基因下降，后面我采用 RNAi 人为让基因下降，如果细胞也死，说明我们找对基因了。不过，如果您想做加药上调基因，也可以，后面高通量功能筛选，基因操作工具也可以用 cas9-SAM 进行过表达高通量功能筛选。不过，风险大些，您的经费要多些。
三、候选基因功能筛选
1、候选基因药物相关性验证
选取的 30 个基因，采用 QPCR 技术，在加药细胞与阴性对照细胞间进行检测。确保进入后续的基因是加药后下降的基因。这里选择 20 个基因进入下游。
2、候选基因操作工具制备
这里的基因操作工具是慢病毒介导的 RNA 干扰。每个基因设计 3 条以上片段，3 个片段混合包装成慢病毒（MIX）。RNAi-MIX 进入下游。
有老师问，为什么不把这 20 个基因的有效片段检测出来后，用单独的有效片段去做呢。这个是单个基因研究和大规模筛选的区别，我们也是跟国外大药厂学习的。大规模筛选的目的是缩小范围，快速并经济的方案是最佳的。等缩小范围了，再细化各个细节。一般我们 20 个基因筛选，阳性率为 10%，会获得 2 个阳性基因。如果我一开始，就把 20 个基因的有效片段都筛选出来，大家可以算算，需要的费用和时间。跟谁比呢，跟我后面只需做这两个基因的有效片段验证，哪个方案更快，更省。（额，这算不算商业机密呀）。注意，RNA 干扰在没有获诺贝儿奖之前，商业化提供服务的时候就说过，一个基因设计 3 个靶点，至少有一个靶点是有效的。所以，MIX 用来进行高通量筛选是最好的选择。
吉凯基因现在有现成的文库，包括 RNA 干扰文库，Cas9 文库（敲除和过表达），和过表达文库。在工具上达到高通量功能筛选的要求。
3、高通量功能筛选
核心步骤。在这一步，我们获得了，MIX 干扰后细胞增殖受到抑制的基因。这个基因总结来说，a、受药物调控，加药后下降。b、采用 RNA 干扰下调后，细胞增殖受到抑制。c、该肿瘤中未报道过。这时我们可以叫他药靶了。
4、工具验证
因为就两个基因，这时就一个一个做了。看看哪个靶点是最有效的。后续的实验就用这个明确的有效靶点。
四、药靶细胞功能学完善
这个基因是有功能的，前面就只有一个细胞功能学实验。这里就采用其他细胞功能学再次确证这个基因的功能。
CCK8、BrdU、细胞凋亡、caspase3/7 活性检测、增殖或凋亡 marker WB 检测、克隆形成等。都是增殖方向的细胞功能学实验。大家注意，吉凯基因提供科研服务，目的是增加您的价值。合作方案到这里，是有承诺的。找到的这个基因，在这些实验中，至少有 3 个实验是阳性的，才算 OK。如果不 OK，返回高通量功能筛选，重新筛。因为我们有工具库，有筛选平台。一切都为提升您的价值。
您想申国自然吗，到这里，有基因了，基因与药物的关系及基因功能也确定了。课题的科学性没有问题了。如果要确保中标率，就看您写标书的文字功底了。
想发文章吗，不建议发，因为，这个基因是个很好的种子。现在去发表，SCI 没有问题，但分值不高。建议把这个种子养养大，养大后，卖个好价钱。啊，不，卖个好分值。
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