手把手课程之 IHC 关键操作步骤
优宁维
本文重点讲述 IHC 操作流程中的关键步骤，并提供数据以支持及解释 CST 在实验过程中所提的建议。最后，本指南列出了 CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的 IHC 试剂。
抗原修复—热诱导的抗原表位修复 (HIER)
缓冲液
适用于 HIER 的缓冲液有多种。而 CST 常推荐的两种缓冲液是：pH6, 10 mM 柠檬酸盐缓冲液和 pH 8, 1 mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。一般而言，EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的 1X 溶液。
抗体：hospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb #2842
样本：蜡包埋人类肺部肿瘤
抗原修复缓冲液：柠檬酸盐缓冲液（左）或者 EDTA 缓冲液（右）
煮沸装置
载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后，才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。虽然，一些研究人员也使用水浴锅，但是，因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。所以，我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到最佳抗原修复效果。
抗体：Phospho–Stat3 (Tyr705)(D3A7) XP. Rabbit mAb #9145
样本：石蜡包埋人类肺部肿瘤样本
煮沸设备：浴锅 (左)，微波炉 (中)，高压锅 (右)
免疫染色—封闭
在 IHC–P 中，我们建议在室温下在含有 Tween20 的 TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品，时长 1 小时，以防止非特异性背景染色。在进行 IHC–F 时，在含有 0.3% Triton. X–100 的 1X TBS 和 5% NGS 中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号；因此，我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。以上针对封闭步骤所提建议均是在以 SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作为检测试剂的情况下提出的。如果选择使用其他检测试剂，我们则建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。
抗体：Phospho–Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb #9718
样本：石蜡包埋人类乳腺肿瘤
封闭：含 5% 山羊血清 (NGS) 的 TBST（左）或者基于酪蛋白封闭剂（右）
一抗孵育—抗体稀释液
在 IHC–P 中，有多种抗体稀释液可供选择，但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。在 CST，我们利用 SignalStain. 抗体稀释液、TBST/5% NGS（含 5% 山羊血清的 TBST）或者 PBST/5%NGS(含 5％ 山羊血清的 PBST) 来稀释一抗。因为合适的稀释剂具有抗体特异性；因此，查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。在进行 IHC–F 过程中，一抗应在封闭缓冲液 (TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS) 中稀释。
抗体：Phospho–Akt (Ser473) (D9E) XP. Rabbit mAb #4060、Phospho–EGF
Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407
样本：石蜡包埋人类乳腺肿瘤（上图）和 HCC827 异种移植物（下图）
抗体稀释：SignalStain. 抗体稀释液（左）或 TBST/5%NGS（右）
检测—检测系统
传统的 IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。这种亲和素–生物素–复合物 (ABC) 系统需要进行两步法检测：包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物，然后进行显色反应。基于生物素的系统容易导致背景染色，特别是含有大量内源性生物素的肝脏、肾脏等组织。因此，我们建议使用基于聚合物的检测系统，如 SignalStain. Boost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素，而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。SignalStain. Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色，其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间，并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。
抗体：Sox2 (D6D9) XP. Rabbit mAb #3579
样本：石蜡包埋的人类肺部肿瘤
检测：基于生物素的检测（左）或基于聚合物的检测（SignalStain. Boost IHC Detection Reagent #8114;（右）
色原
二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。DAB 与 HRP 反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。在实验中建议始终使用高质量的 DAB 底物。在 CST 公司，IHC 小组的 CST 科学家内部鉴定 IHC 抗体所使用的都是 SignalStain. DAB 底物试剂盒。SignalStain. DAB 底物试剂盒敏感性高，且与一抗的作用效果最佳。在 TBST 中清洗 3 x 5 分钟（若为 IHC–F，则在 TBS 中清洗 3 x 5 分钟），以清除未结合的二抗，随后将 100–400μl SignalStain. DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。一般而言，1–10 分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后，将载玻片置于蒸馏水 (dH2O) 中以阻止进一步显色。
抗体：Phospho–Stat3(Tyr705)(D3A7) XP® Rabbit mAb #9145
样本：石蜡包埋的人类乳腺肿瘤
显色检测：利用 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059（左），竞争者提供的 DAB（中和右）
CST 的 IHC/IF 明星产品推荐：
生化试剂：
Catalog Number | Product Name | Product Type | Size | Application |
11932S | Image-iT® FX Signal Enhancer | Buffer | 10ml | IF-P IF-F IF-IC |
12388S | BackDrop® Green Background Suppressor | Buffer | 2.5ml | IF-IC |
14177S | SignalStain® Mounting Medium | Buffer | 60ml | IHC-P |
14746S | SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) | Buffer | 125ml | IHC-P |
14747S | SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) | Buffer | 125ml | IHC-P |
15019S | Animal-Free Blocking Solution (5X) | Buffer | 25ml | W IHC-P |
5425S | Normal Goat Serum | Buffer | 10ml | |
8112S | SignalStain® Antibody Diluent | Buffer | 25ml | IHC-P |
8961S | ProLong®Gold Antifade Reagent with DAPI | Buffer | 10ml | IF-P IF-F IF-IC |
9071S | ProLong®Gold Antifade Reagent | Buffer | 10ml | IF-P IF-F IF-IC |
检测试剂盒：
Catalog Number | Product Name | Product Type | Size | Application |
8059S | SignalStain® DAB Substrate Kit | Detection System Kit | 1Kit | IHC-P |
12692S | SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit | IHC Kit | 1Kit | IHC-P |
65713T | PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel | IHC Kit | 1Kit | mIHC |
78701T | PD-L1, FoxP3, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel | IHC Kit | 1Kit | mIHC |
8109S | SignalStain® Proliferation/Apoptosis IHC Sampler Kit | IHC Kit | 1Kit | IHC-P |
二抗：
Catalog Number | Product Name | Product Type | Size | Application |
4408S | Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F HCA |
4409S | Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC HCA |
4410S | Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
4412S | Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
4413S | Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC HCA |
4414S | Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
4416S | Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
4417S | Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC |
4418S | Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
8114S | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) | Secondary Antibody | 15ml | IHC-P |
8125S | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) | Secondary Antibody | 15ml | IHC-P |
8889S | Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
8890S | Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) | Secondary Antibody | 250µl | IF-IC F |
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