细胞培养过程中的注意事项及试剂配制

五. 细胞传代培养（消化法）

具体操作：

(1) 传代前准备：

1. 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃ 水浴锅内预热。

2. 用75 ％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

3. 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4. 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

5. 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。

6. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7. 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

8. 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

(2) 胰蛋白酶消化；

1. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃ 。

2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

3. 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

(3) 吹打分散细胞：

1. 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml 离心管中。

3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000 转/ 分钟离心6-8 分钟。

4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

(4) 分装稀释细胞：

1. 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×10⁵ /ml 。最后要做好标记。

(5) 继续培养：

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO₂ 培养箱中继续培养。传代细胞2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25 ％时为一个＋，占50 ％为＋＋，占75 ％时为＋＋＋。

传代细胞培养注意事项：

1. 严格的无菌操作

2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

附：EDTA （0.02 ％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：

EDTA 0.20g ，NaCl 8.00g ， KCl 0.20g ， KH₂ PO₄ 0.02g ， 葡萄糖 2.00g ，0.5 ％酚红4ml ，加入蒸馏水定容至1000ml 。10 磅20min 高压灭菌，使用时调节PH 值到7.4 。注意EDTA 不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

六. 细胞的复苏

细胞复苏的原则－快速融化： 必须将冻存在-196℃ 液氮中的细胞快速融化至37℃ ，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作

(1) 实验前准备：

1. 将水浴锅预热至37℃

2. 用75 ％酒精擦拭紫外线照射30min 的超净工作台台面。

3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

(2) ．取出冻存管：

1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

(3) ．迅速解冻：

1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2. 约1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

(4) 平衡离心：

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

(5) 制备细胞悬液：

1. 吸弃上清液。

2. 向离心管内加入10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。

(6) 细胞计数：

细胞浓度以5×10⁵ /ml 为宜。

(7) 培养细胞

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃ 和5 ％CO₂ 的培养箱内2-4 小时（或者24-48 小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：

1 水浴锅未预热或者未预热到37℃ 。

2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。