细胞培养培养基

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细胞培养 （Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。
2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：
3.1. 细胞培养基 通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。
3.2. 材料：
3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)
3.2.2. 粉末培养基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 电磁搅拌器
3.2.5. 无菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空帮浦
3.2.9. CO2 气体
3.3. 步骤：
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。
若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
4. 配制培养基之生长测试
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步骤：
4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。
4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。
4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。
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