细胞培养过程中的注意事项及试剂配制

七. 细胞计数

实验原理： 当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

(1) 准备工作：

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

(2) 细胞悬液制备：

细胞悬液的制备方法是用0.25 ％的胰蛋白酶液消化、PBS 液洗涤后，加入培养液（或Hanks 液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

(3) 细胞计数：

1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2. 制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5 滴细胞悬液到一离心管中，加入5 滴台盼蓝染液（0.4 ％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3. 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16 个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

5. 计算原细胞悬液的细胞数: 按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml ＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×10⁴

说明：公式中除以4 因为计数了4 个大格的细胞数。

公式中乘以2 因为细胞悬液于染液是1 ：1 稀释。

公式中乘以10⁴ 因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm （长）×1.0mm （宽）×0.1mm （高）＝0.1mm³ 而 1ml ＝1000mm³

(4) 细胞计数要点：

1. 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10⁴ 个/ml ，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

2. 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

(5) 初学者易犯的错误：

1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

(6) 本实验特殊试剂的配制：

4 ％台盼蓝母液： 称取4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100 毫升，用滤纸过滤，4℃ 保存。

使用液： 使用时，用PBS 稀释母液至0.4 ％即可。

八. 细胞的冻存

1. 先将冻存管放入4℃ 冰箱，约40min 。

2. 接着置于-20℃ 冰箱，约30-60min 。

3. 置于-80 超低温冰箱中放置过夜。

4. 置于液氮罐中长期保存。

5 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

注意事项：

1. 使用DMSO 前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO 对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2. 不宜将冻存细胞放置在0℃ ～-60℃ 这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“ 危险温区” 。

3. 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。