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        细胞转染后缩为小圆点

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        总有一种转染方法适合你

        pazj:我的细胞转染 48h后在荧光显微镜观察,细胞形态还正常,消化传代以后加G418做稳转,加药以后头两天看,细胞形态还是正常的,但是第三天开始就缩小成小圆点了,感觉就和加胰酶消化后的细胞形态,不知道这个时候细胞是死是活?我还要继续加药吗?还是重新做转染?

        lanniaoxxx认为:

        这种情况应该是细胞死亡的形态表现。建议仔细回想步骤,并查找文献,重新做转染

        wlnju认为:

        如果细胞转染后48小时还可以的话,一般不是转染试剂 的毒性影响。

        但是转染后的细胞传代时,状态会稍稍欠佳的

        第二,加G418筛选是比较常用的方法,我觉得你是不是之前没有筛选出G418的最小致死量?园子里有帖子,搜一下就可以了。一般的是将用浓度梯度的G418筛选正常未处理细胞10-14天,选出10-14天内,将所有细胞杀死的最小G418浓度。由于不同厂商不同批号的G418这个阈值是不一样的,所以你必须做试验前筛出这个浓度。我觉得你G418浓度不对。还有,加入以后,细胞是会出现大量死亡。

        wlnju认为:

        如果不放心,可以重新做一次,但这次的不要扔,继续培养。有克隆 就行。

        lujun298认为:

        应该是G418起作用了,一般加入后两三天以后才会有细胞开始死亡,而且细胞在转染后的接种密度不能太大,否则还没等药物起到筛选作用细胞就会长满,如果转染没问题的话细胞经过十天后会有克隆形成的,我的经验都是CHO转染

        pazj认为:

        哦,按理说,转染成功的细胞对G418有抗性不会死的,可是我的都死了,到了第七天左右,我发现细胞愈来愈多了,没有荧光的细胞增加了。一个六孔板里只有2或3个荧光的细胞了。

        注,转染成功48h时我消化按1:6传代了,操作过程中,我用力过大所剩细胞不多,我在荧光显微镜下看过,大多数是发光的,可是,加药以后就死掉了。活下来的,不发光,现在我一直没扔掉,让它长结果它们长得很好,就是没有荧光。哎,

        wlnju认为:

        ls的,一般G418两三天以后有效浓度就只有原来的一半了

        所以你要两到三天换一次液的。

        monica912:

        我也遇到过这样的问题,这就像是做单抗,得有耐心。

        可以把你传过代且加了G418 存活下来的细胞,如果是贴壁的,可以铺上一层琼脂,然后在荧光显微镜下画出荧光的位置,把它挑出来再进行进一步筛选。

        祝你成功!

        pazj:

        谢谢大家的建议。我现在继续养着这些细胞,有部分圆细胞现在恢复原来形状了,呵呵。不过数目很少,等他长起来还需一段时间。

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