利用热激活引物进行热启动PCR实验

PCR 因具有较高的特异性和可靠性，被广泛应用于遗传检测、亲子鉴定、血液筛査、临床 诊断中，除此之外，PCR 技术也是分子生物学研究领域中非常有用的工具。但是 PCR 技术也有 一些固有的缺陷，主要表现在 PCR 实验中总是不可避免会出现一些非特异性扩增的产物。为了克服这个缺点，目前研究者多采用热启动 PCR （hot start PCR）来降低这些非特异性产 物的扩增。热启动 PCR 是一种改良的 PCR 方法，是一项非常有价值的工具，已被证明可降低靶 DNA 扩增过程中非特异条带的产生。热启动 PCR 的方法很多，目前有人介绍一种新的热启动 PCR 方法，对脱氧核糖核昔 - 5’- 三 磷酸根（dNTP）进行修饰，产生可以热激活的衍生 dNTP，将其引入到引物的 3’末端，产生了 一种新的热激活引物，从而为热启动 PCR 方法带来新的应用前景。

利用热激活引物进行热启动 PCR 实验的基本原理是在 PCR 反应体系中的一种关键成分 —— 引物中引入保护性基团，利用传统的固相合成技术，4-氧-戊基（OXP）和 MAF 这两种磷酸三酯（PTE）修饰基团很容易通过一种被修饰过的亚磷酰胺试剂引入到引物中。有研究显示 OXP 基团在热启动 PCR 中具有广泛的应用前景，因为在高温条件下，OXP 保护基团更易从引物上解离，使引物很快恢复延伸活性，这种转变不需要额外的常规处理。

这种保护性基团的解离可能是由 PCR 反应缓冲液中 Tris 碱的酸化作用导致的，加热可导致 PCR 缓冲液中的 Tris 碱的 pH 值降低，例如在 25 ℃条件下，缓冲液的酸碱性（pH 值）为 8，但是当温度达到 95 ℃， pH 则变成 6。有研究者研究了 PTE 引物转化成 PDE 引物的动态效果，将 PTE 引物与 PCR 缓冲液（25 °C 条件下，pH 为 8.4）在 95 ℃条件下共同孵育，大概 40 min， OXP-引物基本上全部转化成 PDE 引物，半数转化时间被定为 8.5min ± 1.5min，含有两个 OXP 基团修饰的引物转化成相应的未修饰 PDE 引物相对来说就比较复杂，需要分两步来完成 OXP 基团的去除。在 95℃条件下，需要 1〜l.5 h 才能完成彻底转化。

利用热激活引物进行热启动 PCR 实验的基本过程可分为如下几步：

A 热激活引物的合成及溶解 引物设计的原则与普通 PCR 反应中引物相同，只是在合成过程中在引物的 3' 末端寡核昔酸键或者次末端键上引入不耐热的保护基团，此过程可在相应引物 合成公司完成。合成后的引物可用高压灭菌的纯水溶解成终浓度为 25〜100 mmol/L 的贮存液。

B PCR 反应体系的准备 以反应体系为 20 μL 和 50 μL 的 PCR 实验为例来说明 PCR 样品的制备（见表 10-4）。在冰浴放置的 200 μL 微量离心管中依次加入：0.2 mmol/L dNTP。2.5 U Taq DNA 聚合酶、1 X PCR 缓冲液（根据不同供应商，采用相应缓冲液，一般均含有 Mgundefined）、 0.5 μmol/L 正向引物、0.5 μmol/L 反向引物、I ng〜1 μg 的 DNA 模板，其余体积加入灭菌纯水补齐。混匀后，瞬间离心，使反应成分集于管底。

C 反应条件

① 起始模板变性以及引物脱保护基团的温度：94 ℃，10 min。

② 变性温度：94 ℃， 30 s。

③ 退火温度：55〜60 °C， 30 s （一般退火温度在 55〜60 ℃比较合适，在该温度下使引物与模 板杂交一定时间）。

④ 循环内延伸温度：72 ℃， 30 s （一般延伸时间为 I min/1 kb 碱基。500 kb 以内为 30 s，在该 温度下，使复性的引物延伸合适的时间）。

⑤ 最终延伸温度：72 ℃， 10 min 左右。

上述反应步骤中，第 ②〜④ 步为 PCR 的循环反应步骤，一般 PCR 反应可设 30〜40 个循环。

D 结束反应 PCR 产物放置于 4 笆待电泳检测或 -20 °C 长期保存。

E 微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物 直接取 5〜10 μL 产物电泳检测。

F 凝胶染色。

G 凝胶成像系统扫描胶图。

1 PTE 引物最好采用无水保存条件，无水的储存条件会增加引物稳定性。

2 引物的溶解以及 PCR 反应样品的制备过程中一定要釆用高压灭菌的超纯水，因为一些极 性电解质可能会影响 OXP 保护基团的解离速率。

3 单个 OXP 修饰引物的实际激活时间要稍长于其理论半数解离时间，这将有利于保护基团 的有效解离，MAF 修饰引物在 PCR 反应中的扩增效率要低于 OXP 修饰引物。