• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        蛋白质含量测定法/蛋白质沉淀法/Western免疫印迹

        互联网

        3039

        1 蛋白质含量测定法
        2 WESTERN PROTOCOL
        3 Western免疫印迹(Western Blot)
        4 蛋白质沉淀法
        5 蛋白质提取的方法总汇

        1 蛋白质含量测定法
        本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
        蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
        值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。
        考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。
        一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
        样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
        CH2COOH
        | + 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
        NH2
        2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)
        (NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
        反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。
        为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
        计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白
        氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
        五种蛋白质测定方法比较如下:
        方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法
        (Kjedahl法) 灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2% 费时
        8~10小时 将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长 双缩脲法(Biuret法) 灵敏度低
        1~20mg 中速
        20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 硫酸铵;
        Tris缓冲液;
        某些氨基酸 用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏
        50~100mg 快速
        5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶;
        各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正 Folin-酚试剂法(Lowry法) 灵敏度高
        ~5mg 慢速
        40~60
        分钟 双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵;
        Tris缓冲液;
        甘氨酸;
        各种硫醇 耗费时间长;操作要严格计时;
        颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高
        1~5mg 快速
        5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;
        TritonX-100;
        SDS 最好的方法;
        干扰物质少;
        颜色稳定;
        颜色深浅随不同蛋白质变化
        二、双缩脲法(Biuret法)
        (一)实验原理
        双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

        H2O
        O=C C=O
        HN NH
        R-CH CH-R
        O=C Cu C=O
        HN NH
        R-CH CH-R
        H2O

        紫色络合物

        紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
        此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
        (二)试剂与器材
        1. 试剂:
        (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。
        (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。
        2. 器材:
        可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (责任编辑:大汉昆仑王)

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序