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        细胞爬片的免疫组化染色鉴定

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        实验试剂

        PBS,0.5%Triton X-100(DPBS配),3%H2 O2 ,封闭血清 (5%正常二抗血清DPBS液),一抗(PBS配,滴度1:200,湿盒),二抗工作液(湿盒),C液(湿盒),DAB显色液,苏木素,树胶

        实验设备

        20mm盖玻片,90mm培养皿,电子显微镜

        实验步骤

        1. 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2×104 /ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。
        2. PBS清洗标本 3次各 1 min。
        3. 冰丙酮固定 15 min。
        4. 空气干燥 5min。
        5. PBS清洗标本 3次各 2 min。
        6. 0.5%Triton X-100(DPBS配) 孵育 1次 20 min。
        7. PBS清洗标本 3次各 2 min。
        8. 3%H2 O2 孵育 15 min。
        9. DPBS清洗标本 3次各 2 min。
        10. 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。
        11. 一抗孵育(PBS配,滴度1:200,湿盒)4℃过夜或37℃ 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液
        12. PBS清洗标本 3次各 5 min。
        13. 二抗工作液孵育(湿盒) 37℃,30 min。
        14. PBS清洗标本 3次各 5 min。
        15. C液(湿盒) 37℃,30 min。
        16. PBS清洗标本 3次各 5 min。
        17. DAB显色(避光,镜下观察至棕色)约3~10min。
        18. 蒸馏水洗 2次 1 min。
        19. 苏木素复染 0.5~1min。
        20. 自来水洗 30min。
        21. 树胶封片。

        注意事项

        1. 良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意:
        1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上,这样细胞爬片才较牢固,冲洗时不易脱片;
        2) 接种的细胞密度适中,以2×104 /ml为宜,若细胞密度太高,5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
        2. 冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
        3. 冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片)。
        4. 加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜。
        5. Triton X-100表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

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