细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的菌落观察和细菌菌落制片

实验十七 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的菌落观察和细菌菌落制片

　　一、目的要求

　　1．观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。

　　2．学习细菌菌落制片的方法。

　　二、墓本原理

　　菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。

　　利用血液培养基富有营养及粘性等特性来培养细菌，在此培养基上生长的菌落在固定时粘性很大，能够牢固地附着在载玻片或盖玻片上，便于制片和观察。另外，血液培养基又是较好的保存菌种用培养基，故由此培养基所制的菌落制片能保存较长时间。

　　三、器材

　　圆褐固氮菌，枯草芽孢杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；

　　Bouin氏固定液，0．01％结晶紫溶液，羊血或兔血，肉膏蛋白胨琼脂培养基，酒精等。

　　四、操作步骤

　　1．观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验一菌落特征描述的方法记录结果。

　　2．血液琼脂培养基的制备：

　　(1)成分pH7．6肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml，无菌脱纤维羊血（或兔血）1ml。

　　(2)将肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶化。

　　(3)待冷至45℃时，以无菌操作加1ml无菌脱纤维羊血于培养基内，立即摇荡使血液和琼脂培养基充分混匀。

　　(4)迅速以无菌操作倒入平板，使成血液琼脂平板，注意不要产生气泡。

　　(5)置37℃过夜，如无菌生长即可使用。

　　(6)将无菌的平板取出进行划线接种分离单个菌落，因要保持琼脂表面完整，接种改用圆头光滑玻棒，注意不要把琼脂划破。接种后，倒置于37℃温室中培养，次日观察结果。如有单独菌落出现，即可进行下项实验。

　　3．细菌菌落制片

　　(1)细菌菌落印取选择一个较小的单独菌落，用小刀将菌落周围约10—15mm的正方琼脂切下，将此琼脂块上长有菌落的一面朝下，轻放在盖玻片上，然后连同琼脂块将盖玻片小心放于Bouin氏固定液中约1小时，直至琼脂完全变为白色后取出，将琼脂小心剥去，剥时注意勿损伤菌落，仅使菌落留下，附着在盖玻片上。

　　(2)用细水流轻轻冲洗附有菌落的盖玻片。

　　(3)用0．01％结晶紫染液染色3分钟后水洗，吸干。

　　(4)脱水将盖玻片置于由低浓度到高浓度的酒精中（35％、50％、60％、70％、80％、95％、100％）各5分钟，但在100％酒精中浸15分钟。

　　(5)透明取出经过脱水的盖玻片，再放入二甲苯中2分钟。

　　(6)封固从二甲苯中取出盖玻片，用软纸拭去菌落周围的二甲苯。随即加一小滴加拿大乳胶于一洁净载玻片的中央，迅速反转盖玻片，轻轻地放在载玻片上，使加拿大乳胶铺满盖玻片，注意不要产生气泡，如果有气泡即轻轻压出。用低倍显微镜观察其菌落特征。待乳胶完全干燥，一二天后装木匣内保存。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　将观察到的微生物菌落特征填入下表中。

　　

　　2．思考题

　　(1)试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？

　　(2)在用酒精脱水时，为什么要从35％的浓度开始，而不直接放于100％的酒精中？