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        有关质粒共转染的问题

        互联网

        23203

        justinlee719:请教有关质粒共转染的问题!!!!!

        我在做RNAi方面是新手,现在已经构建好载体,正准备转染,我选用的载体是ambion的Psciliner3.1H1-neo,说明书上说质粒里面带有GFP的干扰序列,需要用带有GFP的质粒共转染来做阳性对照,我对这方面现在还不太明白,我想请教一下各位老师对于这个带有GFP的质粒的选择有什么具体要求吗?另外有哪些质粒是专职表达GFP的呢?各位老师谁那是否有相关的质粒没有,是否可以赠送我一些?

        另外还想请教各位一个比较低级的问题,如果我的shRNA表达载体里面不带有GFP这样的基因,那么判断它到底有没有转染进入细胞用什么办法呢?G418筛选好像是进行长期稳定转染用的,但是我用的正常的组织细胞,可能稳转比较困难,那么我在48小时以内如何判断质粒已经转入细胞了呢?

        本人初接触RNAi,还有好多不太懂的地方,希望各位老师不吝赐教!谢谢

        丁香园网友sdjlmu认为:

        我没有见过载体的说明书,不过听你所述,因为载体里含有GFP的干扰序列,所以必须转一个含有GFP的质粒来作为阳性对照,说明载体质粒已被转了细胞里。现在有含有GFP的载体,有N端及C端的,可以将希望表达的目的基因置于其下游或上游,当然也可以做为空载体,只是单纯表达GFP蛋白,约26KD。

        若不转GFP时,还有一个较好的方法,那就是转与不转二个细胞,转后进行细胞裂解,看你所要干扰的目的蛋白的表达量是否降低,若降低,则不仅证明可以转进细胞,还可以说明你的RNAI是有效的。

        丁香园网友seaman_7717认为:

        最好做一个stable clone,这个质粒本来就可以用G418来筛选的。然后你再转GFP的质粒,做阳性对照。其实对于转染效率不高的细胞(系),做stable是很有用的,可以保证整盘细胞转染效率低引起的knock down效率不明显。

        我们阳性对照都是用GAPDH,内源的,容易检测。

        丁香园网友justinlee719

        感谢各位战友的帮助,上周光忙着参加执业医师考试了,没来得及上网看帖子。关于sdjlmu朋友所说的:“现在有含有GFP的载体,有N端及C端的,可以将希望表达的目的基因置于其下游或上游,当然也可以做为空载体,只是单纯表达GFP蛋白,约26KD。”这个不是太明白,想请您解释一下,表达的目的基因置于上游或下游是什么意思?我对这方面接触的不是太多,所以还想请您多指教!

        丁香园网友sdjlmu认为:

        有pEGFP-N2此载体的GFP在载体MCS的N端,因此所表达目的蛋白的N端融合有GFP,C端同上。此载体主要是表达融合蛋白后,便于观察蛋白在细胞内的定位。

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