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        流感病毒 RNA 提取

        相关实验:流感病毒 RNA 提取

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一 材料与设备

        1. 酚提法

        1)10×RSB 溶液:O.Olmol/LTris,O.OOlmol/LKCl,0.0015mol/LMgCL2

        2)10%SDS

        3) 蛋白酶 K,5 mg/ml

        4)lOXLiCI 溶液:5%SDS,0.lmol/L 乙酸钠,1.4mol/LLiCl。

        5)RSB 饱和的酚.

        6) 氯仿:异戊醇 (24:1)

        7)2mol/L 乙酸钠。

        8) 无水乙醇。

        2.LiCl 提取法

        1)TSE 溶液。

        2)10%SDS,

        3) 蛋白酶 K(10 mg/ml)。

        4)lOXLiCl 溶液:5%SDS,0.lmol/L 乙酸钠,1.4mol/LLiCl

        5)LiCl 缓冲液平衡酚

        6) 氯仿

        7)2mol/L 乙酸钠

        8) 无水乙醇,

        3) 酚-SDS 提取法

        1)TSE 溶液

        2)10%SDS

        3)TSE 饱和酚

        4)4mol/LLiCL

        5)2mol/L 乙酸钠。

        6) 无水乙醇。

        二 操作方法

        1. 酚提法


        1) 在 4 ml 纯化病毒悬液中加 1/10 容量 1OXRSB,0.12 ml10%SDS,0,4 ml 蛋白酶 K, 置 56℃15 min

        2) 在上述溶液中加 0.8 mllOXLiCl 溶液和 4 ml 用 RSB 饱和的酚,56°C 振摇 5 min, 立即冰浴。

        3) 加 4 ml 氯仿:异戊醇(24:1),室温摇 15 min,3000r/min,离心 10 min。

        4) 取上层水相,再加 4 mlRSB 饱和酚和 4 ml 氯仿:异戊醇,如此重复 1〜2 次

        5) 取上层水相,加 0.1 倍体积的 2mol/L 乙酸钠,2.5 倍体积的无水乙醇,-20℃ 或-70℃ 下保存。


        2.LiCl 提取法


        1) 纯化病毒重悬于 2 mlTSE 中,加 70ul10%SDS(终浓度为 0.3%), 再加 100ul 蛋白酶 K(10 mg/ml),置 56℃ 下 15 min。

        2) 加 0.2 ml10XLiCl 缓冲液,1 ml 用 LiCl 缓冲液平衡的酚溶液,轻揺,2000r/mm 离心 5 min

        3) 取上层酚相,加 0.5 ml1XLiCl 溶液,提取 1 次,2000r/min 离心 5 min

        4) 取上层水相与 3) 中所得到的下层水相混合,再加 1.2 mlLiCl 平衡的酚,轻摇,2000r/min 离心 5 min。

        5) 弃上层酚相,加 1.2 ml 氯仿,轻揺,2000r/min 离心 5mim。

        6) 取上层水相,加 0.05 倍体积 2mol/L 乙酸钠倍体积的无水乙醇,在-20°C 或-70℃ 保存


        3. 酚-SDS 提取法


        1) 将纯化病毒重悬于 2 mlTSE 中,加 0.2 ml10%SDS,轻摇至悬液澄清为止。

        2) 加 2 mlTSE 饱和酚,在冰浴中轻摇 5 min,3000r/mim 离心 lOmin。

        3) 取上层水相,再用 TSE 饱和酚提取 2〜3 次。

        4) 取上层水相,加 100ul4mol/LLiCl,0.05 倍体积 2mol/L 乙酸钠,2.5 倍体积的无水乙醇,在-20°C 或-70℃ 下保存。
                   

        来源:丁香实验

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