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        正常人胚肺成纤维细胞的培养

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        实验材料:

        1. 肺组织:取自妊娠14—18周的胎儿;

        2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;

        3. 消化液:0.25%胰蛋白酶(pH7.6—7.8),0.02%EDTA溶液;

        4. 培养液:DMEM或RPMI1640,加10%—20%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml;

        5. 保存液:10%二甲亚砜或10%甘油;

        6. 眼科剪、眼科镊等无菌消毒手术器械;

        7. 离心管(15ml、50ml)

        实验方法:

        1. 取水囊引产的妊娠3—6个月的胎儿。用75%乙醇消毒胸壁。剖胸取出两肺。剪去肺内较大的支气管后,将肺边缘组织置于平皿中,用PBS液清洗3次,除去血液。选择苍白色的肺组织,剪成1mm3 左右的碎块。再用PBS液洗2—3次,直至液体澄清为止;

        2. 将肺组织块移入三角瓶中,加入5—6倍量的0.25%胰蛋白酶,密封瓶口。置4℃冰箱内消化20h;

        3. 吸弃上层液体。往三角瓶中加入少量培养液,用吸管反复吹打分散细胞。稍静置,待残存的组织块下沉后,吸出细胞悬液;

        4. 计数细胞,并用培养液调节细胞密度;

        5. 将细胞以3×106 个/ml的密度接种于培养瓶中,于37℃、5%CO2 培养箱中培养。24h后换液,除去未贴壁的细胞及细胞碎片。以后每隔2—3d换液一次;

        6. 待细胞汇合成片后,用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA(1:1,V/V)混合消化液消化细胞,进行继代培养;

        7. 如果要冻存细胞,以便长期使用,可以将成片细胞经消化分散后,悬浮于保存液中,调节细胞密度至1.5×106 —2.0×106 个/ml。每管1—2ml分装入冻存管,置于液氮罐中保存。

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