RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、原理

核酸（ribonucleicacid，RNA）分子在一定pH值的缓冲液中带有电荷，将其放入电场中，可向与其所带电荷电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，核酸分子大小、形状不同，故在电场作用下，核酸分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同，依此可达到分离纯化的目的。

二、材料、仪器设备及试剂

材料：RNA样品液。

（二）仪器设备：1. 电泳仪；2. 玻璃管；3. 试管架；4. 穿刺针头；5. 注射器。

（三）试剂：

1. 20%的单体母液：取重结晶的丙烯酰胺19.0g及甲撑双丙烯酰胺1.0g，蒸馏水溶解，稀释至100ml。

2. Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液：称Tris108.8g，硼酸55.0g，EDTA-Na29.3g蒸馏水溶解，稀释至1000ml，pH＝8.3。用于电极缓冲液时再稀释10倍。

3. β-DMAPN（二甲基氨基丙腈）

4. 1.6%过硫酸铵溶液：称取0.16g过硫酸铵溶于10ml水中。

5. 20%蔗糖-0.2%溴酚蓝溶液：取蔗糖20g，溴酚蓝0.2g溶于100ml水中。

6.0.2%甲烯蓝染液：取0.2g甲烯蓝溶于100mlpH4.7的0.4mol/L Hac缓冲液中，过滤后使用。

7.6%Hac液：取HAc60ml加水至1000ml。

三、实验步骤

（一）制胶：

1. 取玻管（8cm×0.5cm）2支，下端用胶布封闭管口，垂直立在试管架上；

2. 取单体母液3ml，缓冲液1.5ml，β-DMAPN0.06ml，水10ml混匀，再加过硫酸铵0.94ml，混匀后立即分装于各管至刻度处，沿玻管加几滴水封面，静置待凝固。

（二）加样：

1. 取少量RNA样品液和RNA标准液分别加入等体积的20%蔗糖-0.2%溴酚蓝；

2. 剥去凝胶管下端胶布，倒出凝胶表面水，用电泳缓冲液洗涤凝胶表面三次，凝胶管内加满缓冲液，插入电泳槽中，上下槽加足电泳缓冲液，每支凝胶管加RNA样品10～20μl（含RNA50～100μg）。

（三）电泳：

接通电泳仪电源，上槽接负极，下槽接正极。开始时电流应小一些，以1～2mA为宜。待样品进入凝胶后增加至每支凝胶3mA，调至所需电流并保持。待溴酚蓝至凝胶管下端2cm处关闭电源停止电泳，取出凝胶管。

（四）染色及观察：

1. 用5ml注射器吸满蒸馏水，安上穿刺针头，针尖紧贴玻管壁，边旋边向凝胶管侧壁注入水剥离凝胶；

2. 将凝胶放入染色液中染色1h，再用6%Hac脱色，更换数次脱色液，直到背景清晰，一般需脱色24h；

3. 将凝胶泡在6%Hac中，取出后在紫外灯下观察，比较不同样品的电泳区带。