细胞最有力探测法---全内反射荧光显微镜

奥林巴斯高端物镜系列之三 ——TIRFM物镜

全内反射荧光显微镜（TIRFM）是一门非常复杂的光学技术，目前已经被细胞生物学家和神经科学家广泛应用，成为了细胞-基底接触区域内的丰富的细胞生命活动最强有力的探测方法。如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等。

TIRFM技术依赖于斜射光线在两种不同折射率光学介质表面产生的极浅的消逝波。该效应产生的条件是入射介质折射率大于折射介质，并且斜射照射到光学界面时入射角大于全反射临界角。

TIRFM分为棱镜型和物镜型。棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。但棱镜型TIRFM需要在标本上方安装价格昂贵的棱镜系统，而且安装棱镜还会使透射光观察技术受限制，并会造成标本振动。而对物镜型TIRFM而言，则可以克服以上缺点。物镜型TIRFM的物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。因此高数值孔径的物镜的使用是物镜型全内反射荧光成像系统的关键。

由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值孔径（NA）必须大于1.38（NA=nsinθ; nsinθ>nsinθc ；n,θ 分别为物镜的折射率和孔径角；θc为发生全内反射的临界角）。当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围（最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.65-1.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大，降低了操作难度。

奥林巴斯提供的TIRFM物镜，包括了数值孔径1.69的最高分辨率的特殊物（APO100XOHR），这意味着TIRFM能够在小于40纳米深度实施观察。100倍物镜（UAPON 100xO TIRF）和60倍 物镜（APON 60xO TIRF），其数值孔径更是分别达到了1.65、1.49，其明场荧光显微镜的亮度比传统100Xoil/1.4N.A. 物镜提高了28%，分辨率也由0.240μm提高到0.203μm，为单分子影像观察提供更明亮和更佳的对比度。此外150倍的高倍率高数值孔径的物镜(UAPON 150xO TIRF)适用于340nm紫外透射，可应用在紫外激发荧光染料的TIRFM成像中。