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        荧光显微镜检测支原体

        相关实验:荧光显微镜检测支原体

        最新修订时间:

        原理

        检测支原体有两种不同的策略:第一种方法将在下述方案中述及,利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围(在细胞表面或胞质中)的特殊物质进行染色,可显示支原体污染;第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列,进行支原体污染的检测。对这个方案,照试剂供应商(fisher Scientific) 的说明进行。

        材料与仪器

        步骤

        1) 准备下列液体,然后除菌并冷藏。

        无酚红的 HBSS

        NaCl                                   8 g
        KCl                                     0.4 g
        CaCl2                                0.14 g
        MgSO4•7 H2O                  0.1g
        MgCl2•6 H2O                   0.1g
        Na 2   HPO4•2  H2O           0 .06 g
        KH 2 PO4                            0.06 g
        葡萄糖                              1.0 g
        NaHCO3                          0.35 g
        dH2O                               1000 ml

        Hoechst 1000x 贮存液

        柠檬酸/磷酸盐缓冲液(2X)

        0.1mol/L 柠檬酸                         22.2 ml
        0.2mol/LNa 2  HPO4                   2 7.8 ml
        用柠檬酸或 Na 2  HPO4 调节 pH 为  5.5。

        2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。

        3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面,让细胞生长 2~3 天。

        4) 准备 Camoy 固定液(应在每次用前制备新鲜的)。

        Camoy 固定液
        3 份甲醇
        1 份冰乙酸

        5) 吸干培养液,不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液(约 5 ml)室温中放置平皿 2 分钟。

        6) 去除培养皿中液体,加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中(约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。

        7) 重复歩骤 6。

        8) 去除固定液,去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出,让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。

        9) 用 Hoechst1000x 储存液(步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。

        Hoechst 工作液

        工作液宜每次新鲜配制

        用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液(0.5ug/ml)

        用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液(0.05ug/ml)



        用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液;每 Coplin 染缸中加人 40 ml。

        10) 室温条件下,在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液(终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。

        11) 用 dH2O 漂洗两次。

        12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液(在步骤 1 中制备),制备封闭培养液以覆盖住细胞。

        13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液,用纸巾轻轻吸出多余液体。

        14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。

        15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。

        来源:丁香实验

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