少突胶质细胞来源于1-2 天的大鼠。断头后大鼠大脑收集到Ham’s F-12培养液中，移除脑膜和血管。皮质用机械匀浆进行匀浆然后将细胞悬液依次通过230μm和104μm尼龙网进行过滤。细胞通过1000rpm 7分钟离心进行收集，用添加12.5%胎牛血清的DMEM进行重悬细胞。最后以2.0×105 cells/cm2浓度将细胞接种于培养皿中，将培养皿维持在37°C，5%CO2潮湿环境中。3天后更换培养基，以后每两天更换一次。9-11天后细胞能够铺满培养皿。少突胶质细胞祖代生长在星形胶质细胞层的上面然后运用旋转摇床以260rpm 18小时摇荡分离，通过30μm的尼龙网过滤，然后细胞悬液接种到含无血清培养基的培养皿中。
培养基成分：DMEM-Ham‘s F-12混合物（1:1），10mM HEPES，0.1%牛血清蛋白，25μg/mL 人铁转蛋白，30nM三碘甲状腺氨酸，20nM氢化可的松，20nM黄体酮，10nM 维生素H，5μg /mL胰岛素，16μg/mL腐胺，30nM硒，50U/mL 青霉素和50μg/mL 链霉素，还含有2.5ng/mL 血小板源性生长因子AA和2.5ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子用于刺激少突胶质细胞增殖。培养基每两天更换一次。
如果在没有血小板源性生长因子AA和碱性成纤维细胞生长因子的存在情况下，原始的少突胶质细胞在无血清培养基中分化成少突细胞，3天后添加3%胎牛血清。原始细胞和成熟的少突胶质细胞都能用于确定神经毒性。
