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        消化法原代培养实验

        相关实验:细胞的原代培养实验

        最新修订时间:

        简介

        消化法原代培养实验是用将组织块用消化处理获得细胞悬液,接种细胞悬液后部分细胞会黏附于基质开始生长。是原代细胞培养的常用方法。

        原理

        消化法原代培养实验的基本原理是利用化学与生化的手段,将已剪切成较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质(基质、纤维等)加以消化,使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离,形成含单细胞或细胞团的悬液,因单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物,经体外适宜条件培养后,可以得到大量活细胞,在短时间内细胞可生长成片。

        材料与仪器

        器材:

        ① 新生大鼠

        ② 眼科剪、眼科镊

        ③ 培养皿、培养瓶

        ④ 锥形瓶

        ⑤ 磁力搅拌器、磁力搅拌棒

        ⑥ 倒置显微镜

        ⑦ 恒温箱

        ⑧ 含 10% 血清的 DMEM 培养基

        ⑨ 不锈钢筛网(100 目)

        ⑩ 离心机

        试剂:

        ① 75% 乙醇

        ② D-Hanks 液

        ③ 胰蛋白酶(0.25%)

        步骤

        消化法原代培养实验的基本过程可分为以下几步:(以胰蛋白酶消化为例)

        A. 将新生大鼠的肝组织用 D-Hanks 液漂洗 3 次。

        B. 用眼科剪、镊将附着在肝组织上的结缔组织去除。

        C. 将肝组织剪成 1~2 mm3 左右的小块,置于锥形瓶中,放入磁力搅拌棒,再注入 30~50 倍组织量的预热到 37 ℃ 的胰蛋白酶液。

        D. 在磁力搅拌器上对肝组织块进行搅拌 10~20 min。也可将锥形瓶放入水浴或恒温箱中,每 5 min 摇动 1 次。如消化时间较长,可每隔 5 min 取出 2/3 上清液移入另一离心管,离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基,然后再给原锥形瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。

        在 4 ℃ 条件下进行冷消化,消化的时间需延长至 12~24 h。如果肝组织块在冷消化一段时间后,可离心再添加胰蛋白酶,放入 37 ℃ 恒温箱中继续温热消化 20~30 min,效果会较好。

        E. 吸取少量消化液在倒置显微镜下观察,若组织块已分散成小的细胞团或单个细胞,应立即终止消化。

        F. 将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过,除掉未消化充分的大块组织。

        G. 将收集的细胞悬液 800~1000 r/min 离心 3~5 min,去除含胰蛋白酶的上清液。

        H. 用 D-Hanks 液漂洗 1~2 次,每次 800~1000 r/min 离心 3~5 min,去除上清液。

        I. 加入含 10% 血清的 DMEM 培养基,吹打沉淀制悬,按每 1 mL 5x105~1x106 个细胞的浓度接种到培养瓶,于 37 ℃ 条件下培养。

        注意事项

        1. 进行消化法原代培养实验时,因 Ca2+ 和 Mg2+ 及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用,消化过程中使用的所有液体,应均不含有这些离子及血清,消化后可直接加含血清培养基使其灭活。

        2. 在选择消化时间时,应考虑到胰蛋白酶的浓度及 pH 值对消化效果的影响,胰蛋白酶常用浓度为 0.25%,pH8~9,消化时温度最好控制在 37 ℃。一般新配制的胰蛋白酶液消化力很强,所以开始用时要注意观察,严格限制消化时间,以免消化过度。

        3. 胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织,但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。

        4. 由于原代培养过程较长,因此,应严格无菌操作,避免细菌、霉菌等的污染。

        来源:丁香实验

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