【求助】免疫细胞化学方法请教

参与者：sunnyBIO

免疫细胞化学以前没有做过，最近准备做。在网上查找了多种实验方法，但是不知道其中那种方法适合我的实验，希望做过的各位可以给我指点一下。

参与者：zhangyuelin1999

本实验室的免疫细胞化学方法，仅供参考：

1、细胞爬片；

2、PBS洗3次×5min；

3、4%多聚甲醛固定30min（4度冰箱中）；

4、3%H2O2 封闭内源性过氧化物酶，室温下10min；

5、PBS洗3次×5min；

6、10%动物血清封闭，室温下10min；

7、甩去血清（不洗），一抗4℃ 过夜；

8、PBS洗3次×5min；

9、二抗室温下1h （或37℃30min）；

10、PBS洗3次×5min；

11、SABC复合物室温下30min~1h （或37℃30min）；

12、PBS洗3次×5min；

13、DAB显色，镜下观察，自来水终止；

14、苏木素复染；

15、梯度酒精脱水：70%酒精、80%酒精、90%酒精各5min ，95%酒精5min×2，100%酒精5min×2；

16、二甲苯透明20min，中性树胶封固。

参与者：淡泊宁静

1、试剂：

（1）0.01M PBS（NaCl 8g+Na2HP04 1.15g+KH2P04 0.2g———1L（pH7.2）；

（2）稀盐酸酒精溶液：75%酒精配制1%盐酸；

（3）淡氨水溶液：400ml自来水中滴2滴浓氨水；

（4）伊红溶液：0.5g水溶性伊红染料，溶于l00ml双蒸水中；

（5）苏木素染液：苏木素粉0.5g+铵矾24g加双蒸水70ml+NaI 031g+HgO 5g+甘油30ml+冰醋酸2ml，过滤备用；

（6）4%多聚甲醛。

2、操作步骤：

（1）载玻片上接种细胞10E5；

（2）70%Confluency收集细胞，PBS洗2次3min；

（3）4%多聚甲醛固定30min；

（4）PBS洗2次3min；

（5）室温下，0.3%H202封闭15min，以阻断内源性过氧化物酶；

（6）PBS洗3次5min，干燥；

（7）滴加血清50μl/片，湿盒内37度孵育；

（8）去血清，加一抗，湿盒内37℃孵育45min，4度湿盒内保存过夜；

（9）PBS洗3次5min，干燥；

（10）加生物素标记的第二抗体50μl/片，湿盒内37℃孵育30min；

（11）PBS洗3次5min，干燥；

（12）加入链亲和素—过氧化物酶溶液50μl/片，37℃孵育30—60min；

（13）PBS洗3次5min，干燥；

（14）滴加新鲜配制的0.03%H202/0.05%DAB溶液50μl/片，镜下观察显色10-20min；

（15）自来水冲洗终止反应；

（16）苏木素染液染色2min；

（17）自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗；

（18）过氨水溶液返蓝，自来水冲洗。

（19）脱水：70%酒精1次、95%酒精2次、无水乙醇3次，每次lmin；

（20）透明：二甲苯溶液3次，每次lmin；

（21）将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。