干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤

碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

以ALP为目标物的检测方法：

1 Gomori钙钴法

【染色原理】

ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】

3%β-甘油磷酸钠5ml
2%巴比妥钠5ml
蒸馏水10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml

【步骤】

（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2 偶氮偶联法：

【孵育液配制】

萘酚AS-BI磷酸盐 20mg

DMSO 0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml

六偶氮副品红0.5ml

1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）

【步骤】

（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：

【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】

取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。

【步骤】

（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。

（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。

（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。

【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：

4 茜素红法

【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。

（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。

（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。

【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

5 von Kossa法

【作用原理】

Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。

（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。

（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。

（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。

（5）室温下晾干，封固。

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