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基本方案有选择标记的产病毒稳定细胞株的制备

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	二个反转录病毒包装细胞株反转录病毒载体包含选择性标记
试剂、试剂盒	PBS 细胞染色液组织培养皿
仪器、耗材	低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器完全的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基克隆形成环

步骤

1•第1 天，接种 5X IO5 个细胞/6cm皿的 P E 501反转录病毒包装细胞于完全D M E M / 10% FBS 中，孵育 Id。需要二个不同的包装细胞株；第一个细胞株产生的病毒一定能够传染第二个细胞株，也就是，他们一定是不同的但可兼容的假包膜（表 12. 4.3)。 2•第2 天，换 4m l 新鲜的组织培养基。用包含选择标记的反转录病毒载体质粒进行磷酸钙转染（支持方案1 ) 。孵育 Id。 3. 第 3 天， P 及弃转染的P E 5 0 1 细胞的培养基再力口 4m l 新鲜的完全D M E M /10% F B S 。对于每个转染的P E 501细胞皿，接种 5 X IO5 个细胞 /6cm皿的 P A 317细胞于完全 D M E M /10% FBS 中，孵育 Id。第 4 天，给 P A 317细胞换培养基，培养基含4jug/m l 的 Polybrene (储备溶液稀释1000

倍 ) 。 5. 使用IOml注射器，把 3m l 包含病毒的培养基从转染的PE501细胞的每个皿移出，而且用〇.45Mm 的低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器过滤培养基除去活细胞。留 Iml培养基在皿里使细胞不干死。 6. 用 Iml过滤的来自一个转染的PE501细胞皿的包含病毒的培养基传染一个皿的 P A 317细胞，另一个皿用IOjlJ 来自相同的PE501皿的培养基。孵育 5dD 7. 胰蛋白酶消化转染的PE501细胞并以每个皿1 : 2 0 的稀释度接种至6c m 皿里，培养基包含针对选择标记的适当药物，比如〇.75m g /m l G 418， 4m m o l 组氨醇，或 0. 4m g /ml潮霉素B 。孵育 5d。 8. 用 I.5m l 细胞染色液染色5min。用水洗去染色剂。计算集落形成率以估计D N A 的转染效率（典型的转染效率是1000个集落/y g 质粒D N A ) 9. 转染P A 3I7 细胞后Id (第 5 天），胰蛋白酶消化传染的P A 317细胞并以每个皿 9 : 1 0 和 I : 1 0 的稀释度接种至I0c m 皿里，用 IOml包含适当药物的培养基（第 7 步）孵育 5〜10d。 10. 药物抗性集落形成后，使用克隆环从皿里分离包含小量集落的克隆（约 10个集落） (单元3.1)。用包含筛选药物的培养基扩大培养以提供充足的细胞冻存和分析。 11. 当克隆细胞株被充分扩大培养后，每个克隆冻存一或两个玻璃小瓶备用以防止培养物筛选期间偶然遗失，即便是最好的病毒载体生产者。 12. 逋过选择标记的转移测定病毒载体的滴度（支持方案2)。 13. 鉴定那些抗药性克隆，目的细胞能在选择性培养基中生长，分析插入的c D N A 的表达。 M . 抽提克隆的染色体 D N A C 如附录 3A ) 。选择一种限制性内切核酸酶来消化 D N A ，这种限制酶只在病毒的L T R 区存在唯一的酶切位点，而在周围的染色体中任音切割。 1 5 . 用 c D N A 探针 Southern blot杂交分析被消化的 D N A ( 附录 3G )。 16. 用一个原病毒载体检测辅助病毒（支持方案幻的产生并丢弃产生辅助病毒的任何克隆。 17. —旦一个克f奎细胞株被鉴定具有所需的特性，融解备用玻璃小瓶细胞之一（第 n 步），扩培养，并冻结更多的细胞以备将来使用。大夕数的克隆能持续产生病毒 2 个月以上，而且如果病毒滴度下降，融解一个新的玻璃小瓶来使用

备选方案1 没有选择标记产病毒稳定细胞株的制备这个步骤中用pSV2neo作为选择标记质粒，但是其他有选择标记的质粒同样能很好地表达。 P A 3I7 包装细胞被用于这一个例子，但是其他的包装细胞株能被替换。材料（标V 的条目参见附录1) 反转录病毒包装细胞（如 P A 317,见表 12. 4. 1) V 含 4. 5g/L 葡萄糖和 10% 的 FBS (V /V ) 的D M E M (D M E M /10% FBS) 反转录病毒包装细胞（如 P A 317,见表 12. 4. 1) 反转录病毒载体质粒D N A 有选择标记的质粒D N A : 如 pSV2neo 0. 75mg/ml G 418 (活性药物）或其他针对选择标记质粒的选择药物• 6c m 的细胞培养皿克隆环（单元3. 1)，无菌 1. 第 1 天，接种5X 105 个反转录病毒包装细胞P A 317于含4ml D M E M /10% F B S 的 6c m 细胞培养皿中。孵育Id。 2. 第 2 天，换 4m l 新鲜的培养基。用磷酸钙转染法（支持方案D ，共转染1()Mg 反转录病毒载体质粒D N A 和 0 •Ijug或〇.2哗 pSV2neo质粒D N A 。孵育Id。 3. 第 3 天，吸弃转染P A 317的培养基并加4m l新鲜的培养基。孵育 ld。 4.第 4 天，胰蛋白酶消化转染细胞，再以1 :2〜I : 10的稀释度接种到包含750|ug/ml G 418的培养基的IOcm皿中。孵育 5〜K M 。 5. 使用克隆环（单元3.1)，分离包含小量集落的药物抗性克隆，扩大培养。 6•当克隆细胞株充分扩大培养后，每个克隆冻存一或两个玻璃小瓶备用以防止培养物筛选期间偶然遗失，即便是最好的病毒载体生产者。 7. 如果可能，检测细胞株的病毒载体c D N A 编码的蛋白质的产生。 8. 抽提克隆的染色体D N A (附录3A ) 。用限制性内切核酸酶消化和Southern blot杂交分析D N A (附录3G ) 。 9. 确定病毒载体效价。 10. 用标记补偿法检测辅助病毒（支持方案3),扩大培养并收获病毒载体。（基本方案第 16〜18步）。备选方案2 短暂转染的病毒载体的制备材料反转录病毒包装细胞（表 12. 4.1)和适当的细胞培养基反转录病毒质粒D N A 6c m 的细胞培养皿 IOm卜注射器 0. 45p n 的低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器

沉淀缓冲液中并持续搅拌。室温孵育30min。可以观察到淡淡的云雾状混浊，如果重组物保持清亮或者有大的团块样混池，用新鲜的新准备一份新的沉淀溶液。 7.检查管中的沉淀物是均勻的而不是成块的沉淀。把沉淀物加入一个含反转录病毒包装胞的 6cm 皿并摇晃皿使其分布均匀。孵育并着手进行选择或者筛选细胞（基本方案或备选方案2 ) 。支持方案2 确定带选择标记的病毒载体的滴度为不携带标记基因的病毒载体确定滴度更困难：确定这样的病毒载体的滴度可以做被转染细胞的Southern blot杂交（附录 3G)，用被分析的病毒载体或者携带允许滴度直接被确定的选择标记的另一个可匹配的病毒载体。材料（标V 的条目参见附录D 对待检病毒载体的假包膜敏感的细胞（如 NIH 3T 3 或 H e L a 细胞）和合适的细胞培养基 4mg/ml 聚凝胺（ Sigma) 待检的反转录病毒载体原种（如基本方案或备选方案1 或 2) 选择的药物： 0.7511^/1111〇418,0.4111111〇1潮霉素： 6，或 4111111〇1组氨醇〇 V 细胞染色溶液 6c m 的细胞培养皿 1. 第 1 天，接种5XIO5个对病毒载体假包膜敏感的靶细胞在含适当细胞培养基的6cm 细胞培养皿中。孵育Id。 2. 第 2 天，换含4yg/m l 聚凝胺的培养基培养细胞，并加人不同数量的反转录病毒储存液（ 0.01〜1004) 在不同的皿里。孵育Id。 3. 第 3 天，胰蛋白酶消化并以1 :20的稀释度接种到包含适当浓度的药物的培养基里。孵育 5〜8d。 4. 集落形成之后，用 1.5m l 细胞染色溶液染色5min。用 H 2O 洗去染色剂和计数集落。计算病毒滴度。病毒滴度用每毫升形成集落数表示（ C F U /m I) ，是用集落的数目除以原体积 (ml) 即用来转染的是未稀释病毒原种，所以要乘以 2〇以纠正 1 : 2 0 细胞稀释度。支持方案3 辅助病毒的标记补偿检测虽然这个检测略微沉闷而且较慢，但它很可靠并非常敏感。材料 L A P S N 病毒载体（图 12. 4. 2) 对 L A P S N 假包膜敏感的反转录病毒包装细胞（表 12.4.D 和合适的细胞培养基对病毒载体假包膜敏感的天然靶细胞：如 NiH 3T 3 或 HeLa细胞

待检的反转录病毒载体原种（基本方案或者备选方案丄或质结合的纤维素醋酸盐注射式滤器过滤含 4mg/ml 聚凝胺（ sigma) PBS (附录 I PBS 项）阳性对照病毒：双向性有复制能力的辅助病毒一 6c m 的细胞培养皿 2 ) ，用 0. 45jum的低蛋白 IOml注射器 0. 45p n 的低蛋白质结合的纤维素醋酸盐注射器式滤器 1.制备含LAPSN 病毒载体（图 12.4.2)的病毒原种，可以来自短暂转染的反转录病母包装细胞（备选方案2 ) 或者来自稳定的产生病毒载体的细胞株（基本方案或备选方案1)’LA PSN 病每载体可以编码喊性憐酸酶（ aikaiine phosphatase， AP)。 2•用病毒转染天然的靶细胞。传代细胞2 个星期允许辅助病毒（不应该存在）繁殖。 3. 通过传染不包含病毒载体的亲代细胞为病毒载体制备化验细胞。分装那些不释放反转录病毒载体的细胞（非产病毒细胞），它们应该储存在液氮中以备将来的标记补偿使用。非产病毒细胞需要一次产生。 4. 第 1 天，接种 5XlO5 个包含LA PSN 的非产病毒细胞在含适当培养基的6 c m 细胞培养皿中。孵育 Id。 5. 第 2 天，通过加Im l过滤的待检反转录病毒原种， 3mi 细胞培养基和知g/mi 聚凝胺，传染非产病毒细胞。用少量的有双向复制能力的辅助病毒传染一些皿作为阳性对照。 6.从第 3 天起，孵育细胞2 周允许辅助病毒繁殖。一周 2 或 3 次，用胰蛋白酶消化细胞再以 1 : 10〜1 : 4〇接种。保持细胞相对高地密度。 7.第 1 6 天，以 IO5 个细胞每6cm皿接种对病毒载体假包膜敏感的天然靶细胞（与非产病毒细胞株同种的细胞）。同时，更换长满的非产病毒细胞的培养基。孵育 Id。 8•第1 7 天，收获来自非产病毒细胞的培养基和用O . ^ pm 低蛋白质结合的注射式过滤器除去细胞和碎片。 9. 用 Im l含样品的培养基， 3m l细胞培养基和4jLig/m l聚凝胺，传染天然的粑细胞。孵育 Id。 10. 第 19天，染色受传染的靶细胞做碱性磷酸酶活性分析（支持方案4)。染色反应阳性提示来自非产病毒细胞的病毒的感染，由于反转录病毒原种中辅助病毒的存在。支持方案4 染色法检测培养细胞的碱性磷酸酶活性这一方案是针对6cm 皿培养细胞的，但是容易对其他尺寸的皿调整条件。材料（标V 的条目参见附录1) 转染了编码碱性磷酸酶的病毒载体的细胞培养物（如 LAPSN) 在 6 c m 的细胞培养皿中 0 . 2 5 % ( W V ) 戊二醛 /PBS V P B S

V 碱性磷酸酶染色缓冲液 V 碱性磷酸酶染色液 1. 吸弃转染编码碱性磷酸酶的病毒载体的细胞培养物的培养基。室温用3ml 0.25%的戊二醒固定细胞5〜lOmin。使用不转染细胞做为阴性对照和转染已知的产生碱性磷酸酶的细胞做为阳性对照。 2. 用 2〜3ml P B S 洗细胞两次。加 2ml PBS 65°C 加热 30min使细胞的碱性磷酸酶失活。 3. 皿冷却后，吸弃P B S 并用2m l 碱性磷酸酶染色缓冲液洗一次，除去磷酸盐。 4.加 1.5m l 碱性磷酸酶染色液。室温孵育4h (依赖细胞类型和背景碱性磷酸酶活性）。 5. 计算碱性磷酸酶阳性细胞。

来源：丁香实验

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