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        小鼠树突状细胞培养攻略

        互联网

        13424
        一、方法

        根据1999年lutz的方法,做了一些改进,培养DC很多人用的是高浓度的细胞,高浓度的因子,但是这样产量不高,我每一次分离一只小鼠的骨髓,大约可以得到107个细胞,分成10盘,每盘10 ml培养基,用低浓度的细胞因子,这样可以大大提高产量,每次能培养得到undefined107个DC左右,流式细胞术检测:细胞纯度应该大于90%,这个方法还是很好用的。

        二、具体步骤

        1. C57Bl/6小鼠

        2. 处死小鼠,75%酒精浸泡10 min。

        3. 解剖取出小鼠股骨和胫骨。

        4. 取出骨上组织。

        5. 冲洗骨髓腔,直至骨变白。

        6. 收集的细胞沉淀一10 000/ml接种,培养液含200 U/ml rmGM-CSF和IL-4。

        7. 隔天换液并补充细胞因子,到第三天的时候如图:可以见到出芽状的突起,突起还不是特别多,也不是很长。

        8. 第8天的时候,细胞形态已经出来,如图所示:

        细胞形态具有典型的树突状细胞形态,长长的突起,到这个时候细胞已经比较成熟了,补充一下:第七天半量换液的时候,加入TNF-a刺激细胞成熟

        三、相关应用

        1、瞬转树突状细胞

        用包装好的病毒,直接感染DC这样做的,是腺病毒载体,方法如下:

        (1)将培养成功的DC以5×106/孔接种到6孔Costar细胞培养板中;

        (2)每孔加入MOI为200的(Ad-目的基因),37℃、5% CO2饱合湿度下以最小体积的培养液转染4小时。对照组采用相同MOI的Ad-LacZ腺病毒;

        (3)添加新鲜培养液,继续培养48小时后收获DC;

        (4)免疫组织化学检测hTERT的表达。
        基因修饰DC疫苗中目的蛋白的表达鉴定,采用免疫组化方法,主要操作方法如下:
        (1) 将感染染Ad-hTERT的DC滴加到多聚赖氨酸包被的玻片上,室温静置20 min后,用PBS洗2次;
        (2) 4%多聚甲醛室温下固定10 min,用PBS冲洗3次;
        (3) 0.5% Triton-X 100室温作用15 min,用PBS冲洗3次;
        (4) 3%H2O2-甲醛室温作用10 min,用PBS冲洗3次;
        (5) 10%正常山羊血清封闭,湿盒室温孵育30 min;
        Devil. 加1:50兔抗人hTERT一抗工作液,4℃孵育过夜后,用PBS冲洗3次;
        (7) 加入生物素化羊抗兔二抗工作液,37℃湿盒温育20 min,用PBS冲洗3次;
        Musical Note 加入辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液,37℃湿盒温育20 min,用PBS冲洗3次;
        (9) DAB显色3-5 min,终止反应;
        (10) 梯度酒精脱水后烘干,二甲苯透明,中性树胶封片。
        以感染Ad-LacZ的DC及未感染病毒DC为对照,观察hTERT在正常DC中的表达,PBS代替一抗为阴性对照。

        还进一步采用WB方法检测了DC中目的基因的表达。

        四、常见问答

        1. The bones seemed broken instead of sperated from the joint. Does it easierto get contaminated or not?
        答:分离的时候注意严格无菌操作,骨头取出来,去除了骨上组织之后,在75%无水酒精里面浸泡2分钟,然后用1640清洗4次,再冲洗骨髓,不容易被污染。
        2. How many cell will you get genreally from one mouse?
        答:培养之前细胞数大约是10的7次方左右(杂的细胞),培养之后undefined10的7次方,文献报道的是10的8次方,我做得最好的时候也没有那么多,保守一点。

        3. 有个小疑问,DC都比较脆弱,在换液时离心收集细胞是否会造成损伤?半量换液是否可以?
        答:1 000 rpm 8 min 的离心是不会对细胞造成任何伤害的,至少我做的时候没有见到细胞因为离心死去。

        4. 细胞怎么收集?成熟DC贴壁牢吗?
        答:DC前体细胞是贴壁生长的,但是在成熟过程中,细胞是悬浮生长的,不会贴壁,收集的时候收集细胞培养液离心收集。

        5. DC 细胞一般用来做什么样的实验,能转染吗?
        答:DC是专职抗原递呈细胞,能在体内外激活淋巴细胞,可以用于表位鉴定等等,能用于转染,我们就做了转染的。(瞬时转染)
        6. 200 U/mlrmGM-CSF和IL-4 —— 是指两种因子分别是 200 U/ml ?
        答:是的,两种因子的终浓度都是200 U/ml。
        7. 第七天半量换液的时候,加入TNF-a刺激细胞成熟 —— TNF 浓度是多少,为什么加 TNF ?
        答:TNF-α一方面抑制粒细胞的产生,另一方面促进DC的成熟,使其具有很强的刺激T淋巴细胞的活性。因为我做的是要DC体外激活淋巴细胞所以加了TNF,TNF-a我加的终浓度是1 000 U/ml,刺激18小时候就收集细胞

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